越來越多的證據(jù)表明，包括巨噬細胞在內(nèi)的許多非神經(jīng)元細胞類型在痛覺中起著重要作用。有研究提出巨噬細胞在外周疼痛調(diào)節(jié)中的新作用。在小鼠中耗竭巨噬細胞，而不是中性粒細胞或T細胞，能有效地減少切口的發(fā)展和病原體引起的機械和熱敏感性，伴隨著炎癥部位白細胞介素-1β（IL-1β）和其他促痛覺介質(zhì)的下調(diào)。巨噬細胞也被發(fā)現(xiàn)通過間接釋放抗炎介質(zhì)，如IL-10和專門的促溶解介質(zhì)來影響鎮(zhèn)痛。
研究亮點
香港中文大學的研究人員成功利用單細胞RNA測序分析巨噬細胞在組織炎癥和癌癥條件下轉錄組的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)了一種直接促進腫瘤神經(jīng)發(fā)生的“巨噬細胞-神經(jīng)元樣細胞轉化”（“macrophage to neuron-like cell transition”，MNT）現(xiàn)象，并在肺癌模型中進行了巨噬細胞耗竭和命運定位研究，確定巨噬細胞特異性Smad3是在基因組水平上促進MNT的關鍵調(diào)節(jié)因子；它的破壞有效地阻斷了腫瘤的神經(jīng)支配和體內(nèi)腫瘤依賴性的傷害行為。因此，“巨噬細胞-神經(jīng)元樣細胞轉化”（MNT）可能是癌癥疼痛的精確治療靶點。
1. 作者用流式分選從LysM-Cre/ROSA-tdTomato小鼠 LLC肺癌模型的腫瘤中分離出巨噬細胞譜系的細胞，進行10×Genomics scRNA-seq分析——單細胞RNA測序（scRNA-seq）是一種在基因組范圍內(nèi)分辨細胞異質(zhì)性的新興方法，它可以用于分辨發(fā)育過程或者外部刺激過程中的轉錄網(wǎng)絡時序，這種信息通常在群體分析中被掩蓋了；而在腫瘤微環(huán)境中的轉錄組特征和表型是高度動態(tài)的——由于癌細胞的刺激，巨噬細胞的表型可以通過轉錄調(diào)控迅速改變。他們發(fā)現(xiàn)一組高度表達神經(jīng)元分化標志物Tubb3的腫瘤相關巨噬細胞（TAM），根據(jù)MetaCore生物信息學平臺的GO分析（gene ontology），其上調(diào)的差異表達基因與神經(jīng)元生成高度相關。研究人員發(fā)現(xiàn)在活體中的這種LLC腫瘤的Tubb3+ TAM細胞轉錄水平上表現(xiàn)為巨噬細胞標志物表達缺失，而神經(jīng)生成相關基因（如Map1b, Syt13, Cyb5d2, Pax6, Cdon, Wnt5a, Pex2等）表達。雙光子活體成像進一步證實了這種具有神經(jīng)纖維樣形態(tài)的巨噬細胞譜系(tdTomato+)衍生細胞的存在，其鈣外排水平(OGB-1+)增強。脂質(zhì)體氯膦酸鹽介導的巨噬細胞耗竭消除了LLC腫瘤中這種神經(jīng)元樣亞群的形成，Tubb3+ TAM細胞的存在與癌癥相關疼痛反應行為顯著相關。
作者還在10×Gnomics的 scRNA-seq人類非小細胞肺癌(NSCLC)活檢數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了TUBB3+CD68 TAM亞群（有包括BMP7、SHANK、CHL1和PAX6等神經(jīng)元基因的強表達）。這個前所未知的TUBB3+ TAM亞群顯示出與TUBB3+神經(jīng)元細胞類似的神經(jīng)元樣轉錄組特征，與人類神經(jīng)疾病高度相關。在人腎細胞癌和肝細胞癌中也發(fā)現(xiàn)了這種神經(jīng)元樣TAM亞群的存在，并在大規(guī)模的NSCLC患者活檢中進一步證實。通過共聚焦三維成像可視化在NSCLC中的TAM亞群，并通過流式細胞分析檢測其腫瘤特異性定位，比較NSCLC和正常肺組織，表明TUBB3+ TAM亞型在腺癌NSCLC中高度存在，并與人TME中神經(jīng)元分化標志物TUBB3的表達呈正相關。值得注意的是，TUBB3+ TAMs的豐度(TUBB3+ CD68+/CD68+比值> 30%)與老年NSCLC患者較差的生存率顯著相關，它們上調(diào)的差異表達基因與神經(jīng)疾病高度相關(亨廷頓舞蹈病、帕金森病和阿爾茨海默病)，表明這個前所未知的TAM子集對神經(jīng)發(fā)生的潛在貢獻。
2. 為了更好地理解Tubb3+ TAM亞群在腫瘤神經(jīng)發(fā)生中的動態(tài)和潛在貢獻，作者使用最新的生物信息學平臺RNA速率分析—— 一個RNA轉錄和剪切的動力學模型，用于評估單個細胞從而進行最終分化細胞與親本細胞之間的因果推斷——對Tubb3+TAM數(shù)據(jù)進行分析，兩種方法（RNA速率和MuTrans分析方法）均證實Tubb3+ TAM亞群來自巨噬細胞譜系。共聚焦成像技術在活體LysM-Cre/ROSA-tdTomato小鼠LLC腫瘤中觀察到巨噬細胞系來源的Tubb3+細胞，占流式細胞術和圖像分析檢測到的腫瘤Tubb3+細胞總數(shù)的90%以上。為了確認巨噬細胞在TME中直接轉變?yōu)樯窠?jīng)元樣細胞的可能性，通過擬時間分析其發(fā)育階段的關系，結果證實了腫瘤微環(huán)境中Tubb3?Cd68+ TAM在轉錄水平上完全轉變?yōu)門ubb3+ Cd68?神經(jīng)元樣細胞。這些發(fā)現(xiàn)提示了前所未知的“巨噬細胞向神經(jīng)元樣細胞轉化”(MNT)現(xiàn)象，可能是一種以前未知的豐富的神經(jīng)元樣細胞來源，可直接促進腫瘤神經(jīng)支配。
3. 為更好理解Tubb3+TAM亞群在腫瘤神經(jīng)生成中的作用，作者在LLC同源基因肺癌模型的LysM-Cre/iDTR小鼠中進行巨噬細胞耗竭，發(fā)現(xiàn)Tubb3+ TAMs顯著減少，通過體內(nèi)的髓源性巨噬細胞（BMDM）過性轉移能成功地逆轉LLC腫瘤中的Tubb3+ TAMs。他們還發(fā)現(xiàn)體外LLC癌細胞條件培養(yǎng)基(CM)能刺激BMDM中的神經(jīng)元形態(tài)；在TGF-β1刺激下發(fā)現(xiàn)BMDM出現(xiàn)成纖維細胞樣形態(tài)。TGF-β1預處理可進一步增強癌細胞培養(yǎng)基誘導的BMDM神經(jīng)元形態(tài)。與體外TGF-β1相比，CM刺激的BMDM中檢測到更高表達的神經(jīng)元分化介質(zhì)(即Tubb3、NeuN和Pou4f1)，表明癌癥條件是啟動“巨噬細胞向神經(jīng)元樣細胞轉化”(MNT)的關鍵因素。
對MNTs上調(diào)的差異表達基因進行無偏生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了與神經(jīng)遞質(zhì)釋放和受體表達相關的基因網(wǎng)絡。巨噬細胞譜系scRNA-seq分析顯示，突觸前膜鈣離子傳感器(Syt13和Syt14)、神經(jīng)遞質(zhì)合成酶(Aldh9a1和Dagla)和感覺神經(jīng)元功能標記(TrkA和Prph)的表達在“巨噬細胞向神經(jīng)元樣細胞轉化”(MNT)中高度富集，提示MNT在腫瘤感覺中可能發(fā)揮的潛在作用，可能導致癌癥疼痛。
用經(jīng)典的傷害性刺激辣椒素(一種TRPV蛋白的激動劑，TRPV蛋白負責響應癌癥疼痛感)，通過OGB-1成像鈣外流來表征MNTs的生物學功能，結果發(fā)現(xiàn)BMDM衍生的MNTs (Tubb3+ tdTomato+細胞)有鈣流響應，而體外未受刺激的BMDM對照中沒有檢測到響應。BMDM來源的MNTs也對GSK1016790A(痛覺受體Trpv4激動劑)和KCl(神經(jīng)元電壓門控鈣通道激動劑)的刺激有反應。
將體外產(chǎn)生的BMDM來源的MNTs過繼轉移到具有巨噬細胞功能障礙的非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中，MNTs的局部過繼轉移顯著增加了NOD/SCID小鼠的癌癥相關傷害感受反應。在人和小鼠MNT中均能檢測到神經(jīng)元鈣信號(p-CREB和Camk2d)的激活；特別是在MNTs中檢測到疼痛受體Ano1和Trpc1的特異性表達，以及在體內(nèi)LLC腫瘤中表達突觸素的MNTs與體外BMDM衍生的MNTs的神經(jīng)回路形成的聯(lián)系，證明了MNTs參與TME促進癌癥疼痛。這些數(shù)據(jù)表明，MNTs在腫瘤中可能表現(xiàn)出傷害受體樣活性，這可能是癌癥疼痛的潛在治療靶點。
4.共聚焦顯微鏡證實了人類NSCLC活檢樣本的MNTs中存在SMAD3的過度激活，另外Opal多重免疫組化染色證實巨噬細胞特異性Smad3與人類NSCLC中MNTs的豐富度之間的關系。因此，作者研究了在實驗性肺癌模型中的Smad3依賴性TME在MNT中的調(diào)節(jié)作用。結果發(fā)現(xiàn)，在Smad3敲除(Smad3-KO小鼠)的LLC腫瘤TME中，不僅MNT而且腫瘤相關的傷害行為也被大幅度抑制，這意味著Smad3依賴性TME在MNT調(diào)控中起著至關重要的作用。
在體外實驗中，Smad3缺失顯著阻止了LLC癌細胞培養(yǎng)基誘導野生型BMDMs表達神經(jīng)元標記物。作者通過將Smad3-野生型(WT)或Smad3-KO型BMDMs轉入巨噬細胞功能障礙的NOD/SCID小鼠LLC肺癌模型中，發(fā)現(xiàn)過繼轉移野生型BMDM會顯著增加MNT和癌癥相關的傷害行為，而過繼轉移缺乏Smad3的BMDMs (KO-BMDM)則顯著抑制了MNT，提示Smad3在MNT中的重要性。
使用特異性抑制劑SIS3對Smad3進行藥物抑制可以有效地阻斷“巨噬細胞向神經(jīng)元樣細胞轉化”(MNT)及其相關的腫瘤神經(jīng)分布(Tubb3+和NeuN+細胞)和LLC攜帶小鼠的癌癥相關的自發(fā)傷害行為。因此，Smad3可能是靶向MNT驅(qū)動的癌癥神經(jīng)發(fā)生的藥物靶點。（子科生物報道）
