深圳子科生物報道:DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，調(diào)節(jié)著許多生物學(xué)過程。研究這種修飾的金標(biāo)準(zhǔn)方法是亞硫酸氫鹽測序。為此，多家公司推出了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒。這些試劑盒在轉(zhuǎn)化效率上表現(xiàn)不錯，但DNA損失和DNA片段化等問題仍讓人苦惱。

針對這些問題，比利時根特大學(xué)的研究人員近日評估了12種亞硫酸氫鹽試劑盒的表現(xiàn)。他們綜合利用凝膠電泳、定量PCR、數(shù)字PCR以及新一代測序（NGS）等方法，尋找這些試劑盒之間的差異。評估結(jié)果于上周發(fā)表在《PLOS One》上。

亞硫酸氫鹽處理的方法于1992年最早提出，到現(xiàn)在仍然是分析DNA甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)。它的原理大家都清楚，亞硫酸氫鹽處理使未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（mC）保持不變，之后可通過測序分析甲基化圖譜。盡管廣泛使用，但這種方法也有缺點。苛刻的反應(yīng)條件會造成DNA片段化和降解。

在這項研究中，研究人員評估了市場上12種亞硫酸氫鹽試劑盒的表現(xiàn)，重點關(guān)注DNA片段化。這些試劑盒包括Zymo Research的EZ Gold和EZ Lightning，QIAGEN的Epitect和Epitect Fast，默克密理博的CpGenome、Epigentek的Bisulflash和Bisulflash Easy等。

研究人員利用光譜測定（Qubit 2.0熒光計）和dPCR來確定DNA產(chǎn)量，利用凝膠電泳、qPCR和dPCR來評估DNA降解，并利用新一代測序來確定轉(zhuǎn)化效率。他們發(fā)現(xiàn)這些試劑盒存在明顯的差異。

以DNA片段化為例，凝膠電泳分析檢測到Epitect和CpGenome試劑盒存在較大片段，說明它們的片段化程度最低。利用qPCR對88 bp至476 bp的片段進行擴增時，發(fā)現(xiàn)Epitect和CpGenome試劑盒的Cq值最小。同樣地，dPCR通過絕對定量，發(fā)現(xiàn)這兩款試劑盒中的DNA濃度最高。由此可見，這兩款試劑盒造成的DNA片段化最少。

在DNA回收率方面，EZ Gold試劑盒表現(xiàn)最佳，而同一家公司的EZ Lightning試劑盒卻排名第六。研究人員認為，既然這兩種試劑盒采用了相同的DNA脫璜和DNA純化，那么影響DNA回收率的可能是轉(zhuǎn)化緩沖液和轉(zhuǎn)化條件。

至于哪個試劑盒是最佳的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒，研究人員認為這要取決于具體實驗。對于DNA長片段的甲基化研究，Epitect試劑盒是理想之選，因為它造成的片段化最少。在分析短片段時，則要考慮其他因素：如果DNA數(shù)量有限，需要高回收率，則EZ Gold似乎是更好的選擇。

原文檢索

Kint S, De Spiegelaere W, De Kesel J, Vandekerckhove L, Van Criekinge W (2018) Evaluation of bisulfite kits for DNA methylation profiling in terms of DNA fragmentation and DNA recovery using digital PCR. PLoS ONE 13(6): e0199091. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199091