深圳子科生物報道：LPS（脂多糖）是細(xì)菌細(xì)胞膜外膜一個主要的成分，其會被哺乳細(xì)胞的受體TLR4識別，并激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號通路，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的釋放。LPS/TLR4信號通路已經(jīng)研究多年，其中大部分關(guān)鍵的作用蛋白已經(jīng)被鑒定，但是仍有一些問題尚未解決，比如復(fù)合物的動態(tài)組裝是如何實現(xiàn)以及復(fù)合物中關(guān)鍵作用蛋白相對比例是多少。

來自廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點實驗室的研究人員發(fā)表了題為“Quantification of dynamic protein interactions and phosphorylation in LPS signaling pathway by SWATH-MS”的文章，用SWATH-MS定量質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)性地研究了LPS信號通路中關(guān)鍵蛋白TRAF6、MyD88和NEMO復(fù)合物中的動態(tài)蛋白相互作用和磷酸化，揭示了在LPS刺激下Myddosome復(fù)合物中IRAK家族蛋白存在不同的招募速度。

這一研究成果公布在Molecular & Cellular Proteomics雜志上，文章的通訊作者為廈門大學(xué)韓家淮教授和鐘傳奇副教授，第一作者為吳秀榕。

在這篇文章中，研究人員擬利用SWATH-MS技術(shù)去定量分析LPS信號通路中的關(guān)鍵蛋白復(fù)合物。為了純化蛋白復(fù)合物，他們分別建立了Flag-knockin TRAF6、Flag-knockin MyD88和在NEMO敲除細(xì)胞中回補(bǔ)Flag-NEMO這三株RAW 264.7細(xì)胞系。

之后，研究人員利用LPS分別處理這三株細(xì)胞系十個時間點，然后用免疫親和純化(immunoprecipitation)的方法獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物，并用SWATH-MS分析這些樣品。

研究人員在30-40個IP樣品中定量到2500-3000個蛋白，除此以外，他們還在這些樣品中鑒定到2000個左右的磷酸化位點。從這些定量數(shù)據(jù)中，研究人員成功地獲得了所有的已知LPS信號通路中關(guān)鍵蛋白的動態(tài)變化信息。

SWATH-MS結(jié)果顯示，IRAK家族蛋白在招募到MyD88上時，有明顯的時間先后之分，且與現(xiàn)有的報道不同。研究人員還分析了Myddosome中關(guān)鍵蛋白TIRAP和MyD88的比列，顯示MyD88:TIRAP約為5:1，表明MyD88在復(fù)合物中以多聚的形式存在。此外，他們還鑒定到關(guān)鍵蛋白上的一系列磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)NEMO上一個未報道的磷酸化位點，此位點的突變會影響NEMO激活NF-kB的能力。

這項研究系統(tǒng)地分析了LPS中蛋白復(fù)合物中關(guān)鍵蛋白動態(tài)變化和蛋白間的比例，且鑒定了一系列未報道的磷酸化位點，為后續(xù)的LPS信號通路研究提供了豐富的資源。

原文標(biāo)題：

Quantification of dynamic protein interactions and phosphorylation in LPS signaling pathway by SWATH-MS

https://www.mcponline.org/content/early/2019/03/07/mcp.RA119.001380