深圳子科生物報道：兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是兒童最常見惡性腫瘤之一，現(xiàn)階段我國兒童ALL的治愈率約為70%（國際最高治愈率約為80%）?；颊邔ο嚓P(guān)治療藥物的耐藥以及由此引起的復(fù)發(fā)是治愈率難以提升的瓶頸。因此，如何破解兒童白血病耐藥復(fù)發(fā)及其克隆演化機制已成為這一領(lǐng)域的研究焦點。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心、國家兒童醫(yī)學(xué)中心的研究人員發(fā)表了題為“Blocking ATM-dependent NF-κB pathway overcomes niche protection and improves chemotherapy response in acute lymphoblastic leukemia”的文章，率先證實阻斷ALL細(xì)胞中ATM依賴的NF-κB信號通路能夠克服來自骨髓微環(huán)境對化療后微小殘留白血病細(xì)胞的保護作用，顯著提高ALL的化療效果，對臨床后期開展ALL聯(lián)合治療具有重要意義。

這一研究成果公布在血液學(xué)國際權(quán)威學(xué)術(shù)雜志Leukemia（《白血病》，影響因子10.023）上，文章通訊作者分別為上海兒童醫(yī)學(xué)中心兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所所長周斌兵教授，上海兒童醫(yī)學(xué)中心兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所段才聞副研究員和上海市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心主任陳紅專教授。

背景

ALL是兒童最常見惡性腫瘤之一，也是所有兒童疾病中造成死亡的主要原因。通過風(fēng)險分層組合化療和改善支持治療，ALL患者的5年生存率已達到80％以上。然而，近20％的患者仍然會復(fù)發(fā)，導(dǎo)致治療失敗。因此必須進行ALL復(fù)發(fā)綜合機制研究，制定克服耐藥性和ALL復(fù)發(fā)的治療策略。

一系列研究表明遺傳突變會導(dǎo)致兒童ALL的復(fù)發(fā)?？茖W(xué)家們通過基因譜分析和測序確定了幾種復(fù)發(fā)特異性耐藥突變，同時也提出殘留耐藥細(xì)胞可以在化療中存活，然后隨后利用獲得性抗藥性來推動克隆進化，導(dǎo)致白血病快速增殖。然而，剩余的ALL細(xì)胞在化療中所處的位置及其存活機制，尚不清楚。 越來越明顯的是，白血病細(xì)胞與其微環(huán)境（或生態(tài)位）之間的相互作用在疾病復(fù)發(fā)過程中起著重要作用。

骨髓（BM）微環(huán)境是一個復(fù)雜且良好調(diào)節(jié)的微環(huán)境，由非造血基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子組成。它調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞（HSCs）的穩(wěn)態(tài)，并參與ALL的發(fā)病機制和耐藥性。

重要發(fā)現(xiàn)

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心的研究人員此前曾發(fā)現(xiàn)通過化療后ALL細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子會召集BM細(xì)胞，重建了一個不斷發(fā)育的環(huán)境，來保護殘留ALL細(xì)胞。這種細(xì)胞因子，即GDF15，CCL3和CCL4，在ALL進展中起重要作用。然而，這些細(xì)胞因子如何通過化療誘導(dǎo)，仍然未知。

在最新這項研究中，研究組發(fā)現(xiàn)化療引起ALL細(xì)胞基因損傷應(yīng)答（DDR）和NF-κB信號通路激活，其中DDR關(guān)鍵蛋白ATM結(jié)合并激活泛素化連接酶TRAF6，導(dǎo)致NF-κB組份IκB降解，進而使NF-κB核心組份P65蛋白釋放入核，促進其直接下游細(xì)胞因子GDF15，CCL3和CCL4的表達和分泌增加，在骨髓中形成保護殘留白血病細(xì)胞的微環(huán)境，促進導(dǎo)致復(fù)發(fā)微小殘留白血病細(xì)胞的生存，為ALL耐藥復(fù)發(fā)突變的獲得奠定了基礎(chǔ)。

與此同時，研究人員還利用ATM和P65特異性小分子抑制劑體內(nèi)阻斷ATM依賴的NF-κB信號通路，聯(lián)合臨床一線化療藥物，顯著減少微小殘留白血病細(xì)胞并提高ALL的化療效果。

這一研究成果闡明了ALL復(fù)發(fā)前期起始克隆產(chǎn)生的機制，揭示了克服ALL耐藥復(fù)發(fā)潛在的治療靶點，為進一步提高我國兒童ALL治愈率奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

國際血液病權(quán)威專家、哥倫比亞大學(xué)癌癥遺傳研究所Adolfo Ferrando教授高度肯定此項研究成果，他認(rèn)為，ALL的耐藥復(fù)發(fā)是世界性難題，阻斷ATM依賴的NF-κB信號通路提高ALL化療效果具有非常重要的臨床轉(zhuǎn)化和治療意義。

化療引起ALL細(xì)胞系和原代細(xì)胞中的細(xì)胞因子上調(diào)

研究人員以前曾發(fā)現(xiàn)ALL保護微環(huán)境由細(xì)胞因子（GDF15，CCL3和CCL4）重建，這些細(xì)胞因子經(jīng)Cytrarabine（Ara-C）處理后會上調(diào)。

為了確定化療誘導(dǎo)這些細(xì)胞因子的機制，他們用化療藥物Ara-C，柔紅霉素（DNR），巰嘌呤（6-MP），甲氨蝶呤（MTX），長春新堿（VCR），CTX和地塞米松（DEX）治療了兩種ALL細(xì)胞系（Nalm6和Reh），然后通過qRT-PCR測定細(xì)胞因子的表達水平。

如上圖所示，Nalm6和Reh細(xì)胞中GDF15，CCL3和CCL4的mRNA水平以藥物劑量依賴性方式顯著增加。在實驗的不同化學(xué)治療劑中，Ara-C，DNR和6-MP引起了直接DNA損傷和最顯著的細(xì)胞因子上調(diào)，因此用于進一步研究。

為了補充mRNA水平檢測，在用Ara-C，DNR和6-MP處理后，研究人員通過ELISA在Nalm6和Reh細(xì)胞中測定了三種細(xì)胞因子的分泌蛋白水平。結(jié)果顯示，Nalm6和Reh細(xì)胞中三種細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)水平以劑量依賴性方式顯著增加（圖S1C和D）。因此研究人員認(rèn)為化療藥物，特別是DNA損傷劑，可以在不存在BM微環(huán)境的情況下直接誘導(dǎo)ALL細(xì)胞中的趨化因子產(chǎn)生。在化療處理的ALL細(xì)胞系和原代細(xì)胞中，微環(huán)境保護相關(guān)細(xì)胞因子的表達水平增加。

化療后NF-κB通路被激活

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在應(yīng)激條件下能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，如CXCL10和IL6的產(chǎn)生，因此在腫瘤侵襲和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

在最新這項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)NF-βB途徑可能調(diào)節(jié)參與微環(huán)境保護細(xì)胞因子的表達。他們發(fā)現(xiàn)了經(jīng)過Ara-C處理后，IκB蛋白水平會降低（圖3a），NF-κB組分之一——p65，在Nalm6和Reh細(xì)胞中易位到細(xì)胞核中（圖3b;圖S5A）。

這一結(jié)果表明NF-κB途徑經(jīng)Ara-C處理后激活。為了研究NF-κB途徑與細(xì)胞因子上調(diào)之間的因果關(guān)系，研究人員使用CRISPR/Cas9方法（Nalm6-sgP65和Reh-sgP65）構(gòu)建p65敲低細(xì)胞系（圖S5B和C），發(fā)現(xiàn)p65中的細(xì)胞因子在Ara-C，DNR或6-MP處理后，細(xì)胞顯著減少（圖3c;圖S5D）。類似地，NF-κB抑制劑PDTC阻斷p65易位進入細(xì)胞核（圖S5A）并在Nalm6細(xì)胞中Ara-C處理后抑制細(xì)胞因子表達（圖S5E），從而支持NF-κB途徑被激活并參與體外調(diào)節(jié)GDF15，CCL3和CCL4的表達。

阻斷NF-κB途徑增強了ALL細(xì)胞對化學(xué)療法的敏感性

研究人員還分析Nalm6和Reh ALL小鼠模型中阻斷ATM依賴性NF-κB途徑的化學(xué)敏感性。用Ara-C處理2天后，殺死小鼠并通過離體熒光共聚焦成像和FAC從顱骨和BM中檢測到GFP+ ALL細(xì)胞（圖6a）。

如圖6b所示，Nalm6-GFP，Nalm6-sgP65-GFP和Nalm6-shATM-GFP細(xì)胞在化學(xué)療法之前將整個血管浸入顱骨中?；熀驨alm6-sgP65-GFP和Nalm6-shATM-GFP小鼠頭骨中殘余GFP + ALL細(xì)胞的數(shù)量顯著低于Nalm6-GFP小鼠（圖6c，d）。同時，超過10％的GFP+ ALL細(xì)胞保留在Nalm6-GFP小鼠的BM中，而少于5％的GFP+ ALL細(xì)胞保留在Nalm6-sgP65-GFP和Nalm6-shATM-GFP小鼠（圖6e，f）。
這些結(jié)果表明，在體內(nèi)阻斷ATM依賴性NF-κB活化后，Nalm6細(xì)胞對Ara-C的敏感性提高。在Reh ALL異種移植模型中獲得了類似的數(shù)據(jù)（圖S10A-E）。
由于GDF15阻斷抗體可以抑制ALL微環(huán)境，因此研究人員認(rèn)為添加外源GDF15可以逆轉(zhuǎn)阻斷ATM依賴性NF-κB通路的體內(nèi)效應(yīng)。為了驗證這一假設(shè)，他們確定了p65和ATM敲低ALL模型對化療的敏感性是否可以通過外源性添加GDF15來逆轉(zhuǎn)。結(jié)果顯示殘留的白血病細(xì)胞明顯增加了GDF15預(yù)處理后，Ara-C處理的Nalm6-shATM和Nalm6-sgP65（圖6g，h）。（此處采用了賽業(yè)的基因敲入小鼠）

這一研究成果闡明了ALL復(fù)發(fā)前期起始克隆產(chǎn)生的機制，揭示了克服ALL耐藥復(fù)發(fā)潛在的治療靶點，為進一步提高我國兒童ALL治愈率奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

國際血液病權(quán)威專家、哥倫比亞大學(xué)癌癥遺傳研究所Adolfo Ferrando教授高度肯定此項研究成果，他認(rèn)為，ALL的耐藥復(fù)發(fā)是世界性難題，阻斷ATM依賴的NF-κB信號通路提高ALL化療效果具有非常重要的臨床轉(zhuǎn)化和治療意義。

原文標(biāo)題：

Blocking ATM-dependent NF-κB pathway overcomes niche protection and improves chemotherapy response in acute lymphoblastic leukemia

https://www.nature.com/articles/s41375-019-0458-0