深圳子科生物報(bào)道：東方肝膽外科醫(yī)院王紅陽(yáng)院士團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事肝癌的基礎(chǔ)與臨床研究工作。近期，該團(tuán)隊(duì)利用Arraystar Human circRNA 芯片、mRNA表達(dá)譜芯片和miRNA表達(dá)譜芯片對(duì)早期肝癌組織和鄰近正常組織的circRNA, mRNA和miRNA進(jìn)行了全面的差異表達(dá)分析。研究發(fā)現(xiàn)，CircRNA-CDYL（以下稱circ-CDYL）在肝癌早期表達(dá)水平顯著上調(diào)，可促進(jìn)EPCAM陽(yáng)性的肝癌起始細(xì)胞比例上升。Circ-CDYL 通過(guò)吸附miR-892a和miR-328-3p，調(diào)節(jié)肝癌來(lái)源生長(zhǎng)因子HDGF和缺氧誘導(dǎo)因子天冬酰胺羥化酶HIF1AN的表達(dá)，形成了以Circ-CDYL為核心的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)， HDGF下游的PI3K-AKT-mTORC1/β-catenin信號(hào)通路和HIF1AN下游的NOTCH2信號(hào)通路被調(diào)節(jié)，導(dǎo)致致癌蛋白MYC和SURVIVIN表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)了早期肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。干擾Circ-CDYL表達(dá)，同時(shí)聯(lián)合使用靶向PI3K 和HIF1AN分子的抑制劑wortmannin和NOD，可高效抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)，Circ-CDYL或Circ-CDYL聯(lián)合HDGF和HIF1AN，均可作為區(qū)分早期肝癌的獨(dú)立標(biāo)志物。該研究發(fā)表在肝臟病學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊Hepatology（IF:14.079）上（circRNA, mRNA與miRNA芯片實(shí)驗(yàn)均由康成生物提供技術(shù)服務(wù)）。

研究背景
肝癌是一類病情發(fā)展迅速的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)生率和死亡率不斷攀升。由于缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，許多患者不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療，三分之二的肝癌患者確診時(shí)已處于中晚期。因此，尋找特異性的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)顯得十分迫切和必要。目前大部分肝癌研究都集中在肝癌的中晚期階段，而對(duì)肝癌早期的情況知之甚少。
越來(lái)越多的證據(jù)表明，非編碼RNA在人體中具有廣泛的生理病理作用。circRNA是一類異常穩(wěn)定的非編碼RNA分子，其已知的功能包括吸附miRNA或蛋白，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和剪接過(guò)程，以及翻譯短肽，是一種極具潛力的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，目前大多數(shù)circRNA的分子和生物學(xué)功能處于未知狀態(tài)。

研究思路
作者首先通過(guò)Arraystar Human circRNA 芯片、Agilent human mRNA array、Exiqon human microRNA array分析了早期肝癌組織和鄰近正常組織的circRNA，mRNA 和miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有92個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，85個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)；9470個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)，10765個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào)；310個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，142個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。為了進(jìn)一步研究circRNA，miRNA和mRNA之間的相互作用，作者進(jìn)行了RNA互作網(wǎng)絡(luò)分析，并基于ceRNA調(diào)控特點(diǎn)，依據(jù)三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了篩選：1）候選circRNA和mRNA具有共同的miRNA作用元件（MRE）；2）候選circRNA和mRNA在肝癌組織和正常組織中的變化趨勢(shì)一致；3）排除由差異表達(dá)miRNA所介導(dǎo)的互作網(wǎng)絡(luò)。篩選得到了126個(gè)共同上調(diào)的circRNA-mRNA對(duì)和74個(gè)共同下調(diào)的circRNA-mRNA對(duì)。作者最終挑選了在早期肝癌組織中上調(diào)最顯著的Circ-CDYL進(jìn)行下一步研究，Circ-CDYL 通過(guò)吸附miR-892a和miR-328-3p，調(diào)控肝癌來(lái)源生長(zhǎng)因子HDGF和缺氧誘導(dǎo)因子天冬酰胺羥化酶HIF1AN的表達(dá)。隨后作者使用qRT-PCR技術(shù)對(duì)Circ-CDYL、HDGF和HIF1AN在肝癌早期組織（0和A期）和肝癌晚期組織（B和C期）進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果一致。一代測(cè)序結(jié)果證實(shí)了Circ-CDYL來(lái)源于基因CDYL的2號(hào)外顯子，核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)則表明Circ-CDYL在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)，但主要位于細(xì)胞漿中，提示Circ-CDYL可能作為ceRNA發(fā)揮功能。
接下來(lái)作者對(duì)Circ-CDYL的生理功能進(jìn)行了探索，體外敲低和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，Circ-CDYL可促進(jìn)癌癥細(xì)胞增殖（CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)），提升肝癌啟動(dòng)細(xì)胞(T-ICs)和EPCAM+ T-ICs細(xì)胞的比例（FACS），促進(jìn)腫瘤成球生長(zhǎng)（腫瘤成球?qū)嶒?yàn)），增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥的耐受性（FACS檢測(cè)細(xì)胞凋亡）和癌癥細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤能力（小鼠腫瘤移植模型）。
然后，作者對(duì)Circ-CDYL的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。lucifearse報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、miRNA pull-down實(shí)驗(yàn)、結(jié)合位點(diǎn)阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)HDGF和HIF1AN的3’UTR區(qū)分別含有miR-892a作用元件和miR-328-3p作用元件，然而miRNA和靶向mRNA之間不存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。相反，Pearson相關(guān)性分析、Circ-CDYL敲低和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)、HDGF和HIF1AN干擾實(shí)驗(yàn)、FISH共定位實(shí)驗(yàn)、結(jié)合位點(diǎn)阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Circ-CDYL通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)控HDGF和HIF1AN的表達(dá)，該機(jī)制依賴于miR-892a和miR-328-3p。進(jìn)一步的下游信號(hào)通路研究顯示，Circ-CDYL上調(diào)HDGF 和HIF1AN表達(dá)，分別激活PI3K-AKT-mTORC1/β-catenin信號(hào)通路和抑制HIF1AN下游的NOTCH2信號(hào)通路，增強(qiáng)了致癌蛋白MYC和SURVIVIN表達(dá)，從而促進(jìn)早期肝癌的發(fā)生發(fā)展。
最后，作者探索了Circ-CDYL在肝癌臨床治療和診斷上的潛在應(yīng)用價(jià)值。使用PI3K抑制劑wortmannin或者HIF1AN抑制劑NOD處理，可以阻斷由Circ-CDYL引起的MYC和SURVIVIN表達(dá)上調(diào)，而且兩種抑制劑聯(lián)合使用效果最佳。并且，如果在使用兩種抑制劑的同時(shí)，干擾Circ-CDY表達(dá)，可以最大程度的抑制MYC和SURVIVIN表達(dá)，有效降低EPCAM+ T-ICs 的比例，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的最佳抑制效果。在肝癌早期診斷方面，ROC分析顯示，Circ-CDYL、HDGF或HIF1AN三個(gè)分子分別呈現(xiàn)出良好的靈敏度和特異性，而且三種分子聯(lián)用效果最佳，其靈敏性高達(dá)75.36%和特異性高達(dá)66.67%。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖1. Arraystar Human circRNA芯片、mRNA表達(dá)譜芯片和miRNA表達(dá)譜芯片篩選出了一個(gè)在肝癌早期高表達(dá)的cirRNA Circ-CDYL以及由Circ-CDYL驅(qū)動(dòng)的ceRNA網(wǎng)絡(luò), 并通過(guò)qRT-PCR和一代測(cè)序進(jìn)行了表達(dá)和序列驗(yàn)證。
 

圖2. Circ-CDYL的功能試驗(yàn)結(jié)果。Circ-CDYL可促進(jìn)癌癥細(xì)胞增殖（A），提升肝癌啟動(dòng)細(xì)胞(T-ICs)和EPCAM+ T-ICs細(xì)胞的比例（B和E），促進(jìn)腫瘤成球生長(zhǎng)（C），增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥的耐受性（D）和癌癥細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤能力（F）。

圖3. 干擾Circ-CDYL表達(dá)，同時(shí)聯(lián)合使用靶向PI3K 和HIF1AN分子的抑制劑wortmannin和NOD，具有抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳效果。
 圖4.  Circ-CDYL 聯(lián)合 HDGF、HIF1AN分子在早期肝癌診斷上具有極高的靈敏度和特異性。

研究意義
本研究通過(guò)Arraystar Human circRNA 芯片、mRNA表達(dá)譜芯片和miRNA表達(dá)譜芯片篩選出了一個(gè)在肝癌早期高表達(dá)的cirRNA Circ-CDYL以及由Circ-CDYL驅(qū)動(dòng)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。Circ-CDYL 通過(guò)吸附miR-892a和miR-328-3p，促進(jìn)肝癌來(lái)源生長(zhǎng)因子HDGF和缺氧誘導(dǎo)因子天冬酰胺羥化酶HIF1AN的表達(dá)，激活HDGF下游的PI3K-AKT-mTORC1/β-catenin信號(hào)通路和抑制HIF1AN下游的NOTCH2信號(hào)通路，上調(diào)致癌蛋白MYC和SURVIVIN，從而促進(jìn)早期肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。重要的是，本研究在肝癌早期診斷和治療上提供了極有價(jià)值的線索。干擾Circ-CDYL表達(dá)，同時(shí)聯(lián)合使用靶向PI3K 和HIF1AN分子的抑制劑wortmannin和NOD，可高效抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Circ-CDYL、HDGF和HIF1AN三分子聯(lián)用在診斷早期肝癌上呈現(xiàn)出了極高的靈敏度和特異性。
通訊作者介紹
本文的通訊作者是東方肝膽外科醫(yī)院、國(guó)家肝癌科學(xué)中心王紅陽(yáng)教授。王紅陽(yáng)教授是我國(guó)腫瘤學(xué)、分子生物學(xué)著名專家，是教育部長(zhǎng)江特聘教授、中國(guó)工程院院士。現(xiàn)任國(guó)家肝癌科學(xué)中心主任、國(guó)際合作生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中心主任。中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)副理事長(zhǎng)，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)主任委員。王紅陽(yáng)教授長(zhǎng)期從事腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，對(duì)腫瘤的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、肝癌新分子標(biāo)志物鑒定及應(yīng)用等有重要建樹(shù)。在國(guó)際有影響的主流期刊發(fā)表論文200余篇；近五年申報(bào)發(fā)明專利28項(xiàng)，已獲授權(quán)12項(xiàng)（國(guó)際專利2項(xiàng)），主持研發(fā)的Glypican-3肝癌檢測(cè)診斷試劑盒獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）頒發(fā)的三類醫(yī)療器械注冊(cè)證（是我國(guó)第一個(gè)以具有完全自主產(chǎn)權(quán)的單克隆抗體為基礎(chǔ)研發(fā)獲批的試劑盒）。
李亮副研究員為本文共同通訊作者，第一作者是課題組危晏平碩士。在王紅陽(yáng)院士的帶領(lǐng)下，該課題組長(zhǎng)期關(guān)注早期肝癌的診斷及非編碼RNA調(diào)控，相關(guān)系列研究成果發(fā)表在Gut, Hepatology, Cancer letters，F(xiàn)aseb journal等期刊上。

原文鏈接
A Noncoding Regulatory RNAs Network Driven by Circ‐CDYL Acts Specifically in the Early Stages Hepatocellular Carcinoma