深圳子科生物報(bào)道：如今，肥胖已成為一種全球性“流行病”。全球約三分之一人口受到超重或肥胖相關(guān)健康問(wèn)題的困擾。多項(xiàng)研究表明，脂肪組織極大地促成了肥胖相關(guān)疾病。因此，人們希望對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行操控，以達(dá)到治療的目的。不過(guò)，脂肪生成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制仍不大清楚。

近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員在這一領(lǐng)域取得了新進(jìn)展。他們?cè)凇禢ucleic Acids Research》上發(fā)表了題為“Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and posttranscriptional regulation to promote adipogenic differentiation”的論文，闡明了鋅指蛋白Zfp217的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院的博士研究生宋彤星和楊陽(yáng)為并列第一作者，彭健和蔣思文教授為共同通訊作者。

N6-甲基腺嘌呤（m6A）作為真核mRNA上最豐富的修飾，在調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)和譜系轉(zhuǎn)化中起作用。不過(guò)，在脂肪生成的過(guò)程中，哪些蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)了m6A修飾？人們似乎了解得還不多。

鋅指蛋白217（Zfp217）是眾所周知的致癌蛋白，在多種癌癥中上調(diào)，對(duì)胚胎干細(xì)胞的分化至關(guān)重要。值得注意的是，Zfp217將基因轉(zhuǎn)錄與新生RNA上的m6A修飾緊密關(guān)聯(lián)，表明Zfp217在協(xié)調(diào)表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用。于是，研究人員猜測(cè)Zfp217可能通過(guò)調(diào)節(jié)m6A修飾而加速脂肪生成。

Zfp217抑制導(dǎo)致m6A修飾的增加

為了探索Zfp217在成脂分化中的作用，研究人員首先利用siRNA開展了功能缺失實(shí)驗(yàn)。Zfp217的敲低明顯阻斷了脂肪生成，表現(xiàn)為油紅O染色水平下降，以及關(guān)鍵成脂基因PPARγ、aP2、LPL和脂聯(lián)素的表達(dá)水平降低。此外，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)完全敲除Zfp217基因后，3T3L1細(xì)胞中的脂肪生成完全被破壞。此外，他們還委托賽業(yè)生物（Cyagen）制備了Zfp217敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)Zfp217^+/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的脂肪生成減少。這些結(jié)果表明Zfp217對(duì)成脂分化有著重要的影響。

為了篩查Zfp217在3T3L1細(xì)胞中的功能，研究人員通過(guò)斑點(diǎn)印跡和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測(cè)了mRNA中的m6A修飾。與對(duì)照組相比，利用siRNA和CRISPR-Cas9系統(tǒng)處理后，3T3L1細(xì)胞中的m6A水平總體上增加（圖1）。與野生型細(xì)胞相比，Zfp217^+/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的m6A修飾也明顯增加。這些結(jié)果表明Zfp217對(duì)細(xì)胞m6A RNA甲基化至關(guān)重要。

圖1. Zfp217抑制導(dǎo)致3T3L1細(xì)胞中的m6A修飾增加

Zfp217直接激活FTO的轉(zhuǎn)錄

盡管Zfp217的失活影響了m6A修飾，但Zfp217本身并不是甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基化酶，那么Zfp217如何抑制m6A mRNA甲基化？于是，研究人員檢測(cè)了與m6A甲基化相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。有意思的是，Zfp217被敲低后，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達(dá)增高，而去甲基化酶FTO的表達(dá)降低。進(jìn)一步的研究表明，F(xiàn)TO的mRNA水平受到Zfp217過(guò)表達(dá)或敲低的調(diào)控。于是，他們想驗(yàn)證Zfp217是否作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控FTO的表達(dá)。

研究人員利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來(lái)驗(yàn)證Zfp217增強(qiáng)了FTO的啟動(dòng)子活性，而FTO啟動(dòng)子上結(jié)合序列的缺失抑制了其活性，說(shuō)明Zfp217對(duì)FTO的直接調(diào)控（圖2）。同時(shí)，F(xiàn)TO拯救了因缺乏Zfp217而造成的脂肪生成受阻，并增加了PPARγ、aP2、LPL和脂聯(lián)素的表達(dá)。這些結(jié)果表明，Zfp217作為轉(zhuǎn)錄因子與FTO基因的啟動(dòng)子結(jié)合，以增強(qiáng)脂肪生成。

圖2. Zfp217激活了FTO的轉(zhuǎn)錄

Zfp217與YTHDF2發(fā)生相互作用

之前的報(bào)道稱，Zfp217通過(guò)與胚胎發(fā)育和腫瘤中的其他蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮其功能。為了進(jìn)一步探索Zfp217促進(jìn)脂肪生成的分子機(jī)制，研究人員又開展了免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)。他們?cè)?T3L1細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了Zfp217和YTHDF2之間的特異性相互作用。

為了確認(rèn)亞細(xì)胞相互作用，他們分離出細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分來(lái)測(cè)定Zfp217和YTHDF2表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，這兩種蛋白質(zhì)都分布在整個(gè)細(xì)胞中，不過(guò)Zfp217在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)比細(xì)胞核更多。此外，共聚焦顯微鏡分析也觀察到兩種蛋白質(zhì)同時(shí)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，表明YTHDF2可能在Zfp217依賴的脂肪生成中發(fā)揮特定功能。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2在熱應(yīng)激下可通過(guò)抑制FTO活性來(lái)維持m6A的水平。于是，研究人員進(jìn)一步分析了YTHDF2和Zfp217與FTO之間的相互作用。正如預(yù)期，F(xiàn)TO和Zfp217的過(guò)表達(dá)都顯示出較低的m6A水平，且YTHDF2阻斷了FTO的去甲基化酶活性，而Zfp217作為調(diào)控因子，讓平衡傾向于去甲基化（圖3）。

此外，他們通過(guò)m6A RNA pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FTO和YTHDF2在靶向m6A ssRNA上的直接競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。顯然，不與RNA結(jié)合的Zfp217干擾YTHDF2的位置，讓FTO與RNA結(jié)合。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)也證明，Zfp217與YTHDF2發(fā)生相互作用，以維持FTO的m6A去甲基化活性。

圖3. Zfp217影響了YTHDF2和FTO之間的競(jìng)爭(zhēng)

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究首次證明了Zfp217在脂肪生成中的復(fù)雜作用。Zfp217與m6A去甲基化酶FTO的啟動(dòng)子直接結(jié)合，并與m6A“閱讀器”蛋白YTHDF2相互作用，從而增強(qiáng)了FTO對(duì)m6A RNA的去甲基化酶活性。最終，Zfp217以依賴于m6A-YTHDF2的方式促進(jìn)脂肪生成（圖4）。

圖4. Zfp217在脂肪生成中調(diào)控m6A修飾的示意圖

這是國(guó)際上首次報(bào)道RNA表觀修飾調(diào)控脂肪細(xì)胞生成的分子機(jī)制，是對(duì)脂肪細(xì)胞生成調(diào)控機(jī)制的全新認(rèn)識(shí)，對(duì)拓展相關(guān)研究領(lǐng)域具有重要意義。

原文檢索

Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and post-transcriptional regulation to promote adipogenic differentiation

Nucleic Acids Research, gkz312, https://doi.org/10.1093/nar/gkz312