深圳子科生物報(bào)道：致死基因是指基因功能缺失導(dǎo)致個體在胚胎期和出生后死亡的一類基因，包括胚胎期致死基因和出生后致死基因。研究預(yù)測致死基因約占小鼠總基因的30%，因其在機(jī)體中發(fā)揮重要作用而備受關(guān)注。

來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王松靈教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表題為"Generating viable mice with heritable embryonically lethal mutations using the CRISPR/Cas9 system in two-cell embryos"的研究成果，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)建了二細(xì)胞胚胎一步顯微注射法構(gòu)建致死基因敲除小鼠模型的新方法。

這一研究成果公布在Nature Communications雜志上，已申報(bào)國家發(fā)明專利。文章第一作者為首都醫(yī)科大學(xué)仵毅博士與張婧博士，王松靈教授與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院陳柏安副教授為共同通訊作者。

王松靈教授團(tuán)隊(duì)長期研究唾液腺功能，基于唾液腺發(fā)現(xiàn)人細(xì)胞膜上硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道Sialin蛋白（由Slc17a5基因編碼），但由于Slc17a5基因是出生后致死基因（敲除該基因的小鼠在出生后3周內(nèi)即死亡），因此如何構(gòu)建成年期Slc17a5基因敲除小鼠模型成為研究該基因在成體內(nèi)功能的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸和難題。

基于Cre/Loxp重組系統(tǒng)的條件性基因敲除小鼠模型是研究致死基因成年機(jī)體內(nèi)功能的現(xiàn)有方法，但該方法存在制作難度高、周期長（2年以上）等缺點(diǎn)，同時無法快速實(shí)現(xiàn)致死基因體內(nèi)功能篩查，資源占用量大，不利于致死基因功能的研究。

近幾年發(fā)展起來的CRISPR/Cas9是一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因敲除效率高，傳統(tǒng)的受精卵顯微注射方式通常造成致死基因全身性敲除的首建鼠無法出生（胚胎期致死基因）或性成熟前死亡（出生后致死基因），因此運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過受精卵注射方式亦無法構(gòu)建可傳代繁育的致死基因全身性敲除小鼠模型。

針對上述兩個傳統(tǒng)技術(shù)的不足，王松靈教授團(tuán)隊(duì)探討研發(fā)高效構(gòu)建致死基因敲除小鼠模型的技術(shù)，形成基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)將sgRNA和Cas9 mRNA或蛋白質(zhì)在二細(xì)胞胚胎期一次注射至其中一個卵裂球的研究策略（見下圖）。王松靈教授團(tuán)隊(duì)利用該策略成功構(gòu)建了Slc17a5出生后致死基因敲除嵌合小鼠，該小鼠可以攜帶致死基因突變并傳代繁育，并發(fā)現(xiàn)Slc17a5基因敲除可致成年小鼠頜下腺組織內(nèi)硝酸鹽與唾液酸的轉(zhuǎn)運(yùn)明顯低下。

為了驗(yàn)證該策略的廣譜適用性，該研究團(tuán)隊(duì)隨機(jī)選取了另外一個出生后致死基因Ctla4和兩個胚胎致死基因Virma及Dpm1，利用該策略構(gòu)建了這些基因的敲除嵌合小鼠，發(fā)現(xiàn)該類小鼠均可攜帶這些致死基因突變并傳代繁育。利用本方法構(gòu)建的小鼠可研究致死基因成年期的功能，如發(fā)現(xiàn)Virma基因敲除會導(dǎo)致成年小鼠局灶性節(jié)段性腎小球硬化；Ctla4基因敲除可致小鼠成年期脾臟內(nèi)Treg細(xì)胞增殖。

這項(xiàng)研究創(chuàng)建的二細(xì)胞胚胎一步注射法既解決了傳統(tǒng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)方法無法構(gòu)建全身性致死基因敲除小鼠的難題，又彌補(bǔ)了常規(guī)條件性基因敲除小鼠模型無法快速實(shí)現(xiàn)致死基因組織功能篩查的缺陷，從而為致死基因體內(nèi)功能研究提供新的技術(shù)和思路。該研究的發(fā)表也標(biāo)志著首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部在基因工程動物模型構(gòu)建方面具有較好水平，能滿足校內(nèi)外眾多領(lǐng)域關(guān)于致死性基因和常規(guī)基因敲除、基因編輯、腦重大疾病動物模型構(gòu)建等動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)需求。

原文標(biāo)題：

Generating viable mice with heritable embryonically lethal mutations using the CRISPR/Cas9 system in two-cell embryos