深圳子科生物報道：胚胎著床是包括人類在內(nèi)的哺乳動物發(fā)育過程中的里程碑事件，生理狀態(tài)下超過半數(shù)以上的人類胚胎由于無法順利著床導致不孕。既往研究通常使用小鼠和食蟹猴等模式生物對這一過程展開探索，然而調(diào)控圍著床時期胚胎發(fā)育的分子機制和形態(tài)學變化特征在不同物種之間存在較大差異，這使得在小鼠等模式生物研究中獲得的調(diào)控規(guī)律較難為人類胚胎發(fā)育研究提供有價值的線索。

然而，由于人類胚胎著床發(fā)生在受精卵形成后一周左右的時間點，這使得研究者們無法獲得生理狀況下的這一發(fā)育階段的人類胚胎。

長期以來，這一人類關(guān)鍵發(fā)育階段一直成為發(fā)育生物學研究的黑匣子。為了深入探討這一過程中的分子動態(tài)規(guī)律，挖掘調(diào)控胚胎著床過程中的潛在分子機制，2019年8月22日，北京大學生命科學學院、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）湯富酬課題組攜手北京大學第三醫(yī)院喬杰課題組合作在Nature在線發(fā)表了題為Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation的研究論文。

研究人員結(jié)合體外模擬人類著床策略1和高精度單細胞多組學測序技術(shù)2,3（single-cell RNA-seq, single-cell Trio-seq2），首次利用單細胞轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組圖譜重構(gòu)了人類胚胎著床過程，系統(tǒng)解析了這一關(guān)鍵發(fā)育過程中的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和DNA甲基化動態(tài)變化過程。研究者們發(fā)現(xiàn)圍著床時期人類胚胎的三個主要細胞譜系（上胚層、原始內(nèi)胚層、滋養(yǎng)外胚層）表現(xiàn)出獨特的發(fā)育特征，而且胚胎在這一時期迅速呈現(xiàn)出母胎連接預(yù)備狀態(tài)；隨后，作者發(fā)現(xiàn)在可觀察事件窗口期內(nèi)（體外培養(yǎng)day12以前），雌雄胚胎的X染色體劑量并未達到平衡，且雌性胚胎逐漸啟動并逐漸呈現(xiàn)出父源或母源X染色體隨機失活趨勢；最后，研究者們利用單細胞多組學測序手段發(fā)現(xiàn)不同細胞譜系具有截然不同的DNA甲基化動態(tài)變化特征，提示基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和DNA甲基化可能共同協(xié)調(diào)決定囊胚階段后的細胞譜系命運決定。

引言

人類胚胎發(fā)育從具有全能性的受精卵開始，伴隨著多次卵裂和分裂從而形成一個具有特定結(jié)構(gòu)的囊胚。囊胚主要由外圍的外滋養(yǎng)層細胞（trophectoderm，TE）和內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM）細胞組成，而成熟的內(nèi)細胞團會進一步發(fā)育成為具有多能性的上胚層（epiblast，EPI）和原始內(nèi)胚層（primitive endoderm，PE）。囊胚著床之后TE主要分化為胚外滋養(yǎng)層結(jié)構(gòu)，例如胎盤等；而上胚層主要會發(fā)育形成胎體的各個組織器官。隨著體外受精技術(shù)的革新，人類早期著床前胚胎發(fā)育過程被廣泛研究 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 4,5。然而，在發(fā)育的第5-7天，胚胎必須通過著床進入母體子宮壁才能繼續(xù)存活和發(fā)育，隨后逐漸形成原腸胚，并進一步分化形成各類器官和組織原基。

著床失敗是導致早期流產(chǎn)的重要因素之一6。然而研究者們幾乎無法獲得自然受孕后的早期著床后階段的人類胚胎，導致人們對胚胎發(fā)育過程中這一關(guān)鍵階段的譜系特化和分子調(diào)控等規(guī)律知之甚少。猴子胚胎曾被用于早期胚胎發(fā)育研究7，但著床后早期胚胎的猴子模型與人類仍然存在一定的物種差異。小鼠作為最常見模式生物被廣泛應(yīng)用于早期胚胎研究。人類囊胚與子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)體系為模擬體內(nèi)著床后發(fā)育過程提供了另一實驗策略8，然而這類研究策略對于著床后發(fā)育過程的重現(xiàn)程度和可重復性存在一定問題。尤其是該體系必須有母體組織的參與，因此較難被推廣使用，且無法應(yīng)用于胚胎的自主性構(gòu)建（self-organization）研究。

2016年，Magdalena Zernicka-Goetz實驗室建立了小鼠著床后胚胎的體外培養(yǎng)體系，該研究組利用獨特的培養(yǎng)條件將小鼠著床前的囊胚進行體外培養(yǎng)，直至形成類似于著床后胚胎的三胚層結(jié)構(gòu)，為闡明早期著床后胚胎發(fā)育提供了重要實驗手段9。

然而，不同哺乳動物胚胎類型之間存在較明顯的物種差異，說明從小鼠到人類之間的發(fā)育過程的研究推理從而獲得的有效結(jié)論非常有限，這意味著人類著床后胚胎形態(tài)學和分子調(diào)控等變化規(guī)律最好能直接通過人類胚胎研究來獲取。相比小鼠來說，人類囊胚形成過程中的分子和細胞學機制研究仍然偏少，已有研究暗示二者在譜系分化和功能方面存在時間和潛能上的巨大差異10。

Ali H. Brivanlou實驗室以及Magdalena Zernicka-Goetz實驗室近期將小鼠著床后胚胎培養(yǎng)體系進一步發(fā)展至人類胚胎，新建的培養(yǎng)體系同樣能促進人類胚胎在體外經(jīng)歷著床前向著床后的轉(zhuǎn)化與發(fā)育，培養(yǎng)體系無需母體組織參與；形態(tài)學證據(jù)揭示了在這一階段人類胚胎發(fā)育的主要特征，表明人類胚胎在著床后期具有自我構(gòu)建（self-organization）特性，這極大的豐富了人們對于人類胚胎著床這一生物學過程的認識1,11。

細胞身份識別和命運取決于其基因表達網(wǎng)絡(luò)，同時該網(wǎng)絡(luò)受到復雜的遺傳和表觀遺傳學等機制調(diào)控。解析人類胚胎細胞基因表達的時空特異性模式對于了解胚胎早期發(fā)育過程至關(guān)重要。將單細胞分辨率組學檢測技術(shù)應(yīng)用于人類胚胎發(fā)育研究使人們精確認識這一過程成為了可能。

湯富酬課題組和喬杰課題組長期緊密合作，致力于包括著床前胚胎在內(nèi)的人類生殖系細胞發(fā)育過程中基因表達、表觀遺傳學調(diào)控特征和潛在的機制研究：2013年，結(jié)合湯富酬課題組發(fā)展的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)12，繪制了人類著床前胚胎的高精度單細胞基因表達特征圖譜（Nature Structural & Molecular Biology，201313；2014年，該課題組利用新發(fā)展的微量細胞DNA甲基化組測序技術(shù)系統(tǒng)解析了人類著床前胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化組重編程動態(tài)特征（Nature，201414；2018年，該團隊利用單細胞DNA甲基化高通量測序技術(shù)在單細胞水平解析了人類著床前胚胎發(fā)育的DNA甲基化組圖譜（Nature Genetics，201815。同年，他們利用單細胞多組學測序技術(shù)解析了人類著床前胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化組和染色質(zhì)狀態(tài)組的重編程過程，以及染色質(zhì)狀態(tài)與DNA甲基化之間的相互關(guān)系（Nature Cell Biology，201816。以上各項研究極大豐富了人們對于人類著床前胚胎基因表達和表觀遺傳調(diào)控規(guī)律的認知。此外，多個課題組曾利用一系列單細胞技術(shù)對人類著床前胚胎的分子表達譜進行了系統(tǒng)性解析 17,18。

然而受困于技術(shù)限制，胚胎著床這一關(guān)鍵發(fā)育階段的多維度分子表達特征，尤其是該過程中譜系特異性分子表達譜和潛在的調(diào)控規(guī)律長期以來一直是未解之謎。

為此，兩個課題組再次攜手合作，結(jié)合人類胚胎體外培養(yǎng)體系與單細胞組學技術(shù)（單細胞轉(zhuǎn)錄組和多組學測序），系統(tǒng)揭示了人類早期著床后胚胎發(fā)育過程中的分子表達圖譜，并在此基礎(chǔ)上挖掘了基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、DNA甲基化動態(tài)特征等潛在分子調(diào)控機制。

結(jié)果

1. 人類胚胎在囊胚階段后期具備體外自我生長能力（體外模擬胚胎著床）

為了證實胚胎在體外無母體組織參與情況下的著床過程，研究者根據(jù)已報道胚胎培養(yǎng)策略重現(xiàn)了胚胎形態(tài)學動態(tài)變化特征 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 1,11。證據(jù)顯示胚胎在無母體組織參與下能發(fā)育至第12/14天，胚胎逐漸呈現(xiàn)出特異性的形態(tài)學特征，例如滋養(yǎng)外胚層細胞數(shù)量大幅度增加，上胚層逐漸形成羊膜腔以及原始內(nèi)胚層逐漸生長并逐漸包圍上胚層。根據(jù)國際倫理學準則，研究者們在第14天終止了體外胚胎培養(yǎng)實驗。

2. 不同細胞譜系的關(guān)鍵發(fā)育特征以及特征性基因挖掘

研究者利用已知的譜系標志基因?qū)矔r期的胚胎細胞進行了譜系鑒定，結(jié)果顯示胚胎基本維持了囊胚晚期的三個主要細胞譜系（上胚層、原始內(nèi)胚層、滋養(yǎng)外胚層）。有趣的是，各個譜系均逐漸呈現(xiàn)出各自獨特的基因表達特征，例如上胚層呈現(xiàn)出明確的多能性轉(zhuǎn)變（pluripotency transition），原始內(nèi)胚層則逐漸開始表達卵黃囊發(fā)育相關(guān)基因（例如CD44），而滋養(yǎng)外胚層則逐漸開始表達荷爾蒙相關(guān)基因（例如CGB家族基因），以上特征均提示胚胎在這一關(guān)鍵發(fā)育階段逐漸呈現(xiàn)出母胎連接預(yù)備狀態(tài)。不同細胞譜系之間的基因表達對比分析，各類細胞譜系均具備獨特的特征性基因（signature gene）。且部分基因與已發(fā)表食蟹猴圍著床時期胚胎相關(guān)譜系的基因表達特征類似。

另一方面，OTX2過去曾被報道是圍著床時期胚胎上胚層（EPI）多能性轉(zhuǎn)化（pluripotency transition）的重要標志基因19，然而在本研究中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示OTX2主要表達在原始內(nèi)胚層（PE），而并非上胚層（EPI）。進一步全胚胎免疫熒光染色顯示OTX2表達在部分原始內(nèi)胚層細胞中，與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。這表明具有相同發(fā)育來源（內(nèi)細胞團起源）的兩類細胞（上胚層細胞和原始內(nèi)胚層細胞）可能攜帶特殊基因表達痕跡。這些數(shù)據(jù)提示該研究中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的潛在資源價值，新的譜系標記基因鑒定可能有助于早期胚胎中的譜系鑒定和干/祖細胞衍生研究。

3. 滋養(yǎng)外胚層特化成為兩類亞群

研究者們發(fā)現(xiàn)隨著圍著床時期胚胎的發(fā)育，滋養(yǎng)外胚層逐漸形成兩類亞群，其中一類亞群主要表達女性妊娠相關(guān)基因，而另一類亞群則幾乎不表達該類基因。隨后這兩類細胞被鑒定為細胞滋養(yǎng)層細胞（cytotrophoblasts，CTs）和合胞滋養(yǎng)層細胞（syncytiotrophoblasts，STs），除激素相關(guān)基因外，合胞滋養(yǎng)層細胞（STs）還表達部分新發(fā)現(xiàn)的基因，例如TCL6和TBX3）。

4. X染色體劑量平衡

自1961年Lyon等人報道雌雄個體之間的X染色體劑量特征后，X染色體劑量平衡一直是發(fā)育生物學關(guān)注的焦點之一20。X染色體失活（XCI）對于女性（XX）與男性（XY）之間X連鎖基因的劑量平衡具有重要意義，同時X染色體上調(diào)（XCU）對于X連鎖基因與常染色體基因之間的劑量平衡具有重要意義。2016年Fredrik Lanner團隊曾報道雌雄胚胎的X染色體劑量在囊胚階段幾乎已達平衡，且為X染色體阻滯模式（X-dampening，雌性細胞兩條X染色體劑量均部分下調(diào)）17。

在本研究中，作者們捕獲到了多個階段的雌雄胚胎，這為系統(tǒng)揭示這一過程中的關(guān)鍵生物學細節(jié)提供了可能。可追蹤父母源等位基因表達的單細胞全長轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示，在可觀察事件窗口內(nèi)（day12以前），雌雄胚胎的X染色體劑量并未達到平衡，且雌性胚胎逐漸啟動并逐漸呈現(xiàn)出父源或者母源X染色體隨機失活趨勢（XCI）。另一方面，X染色體劑量應(yīng)與常染色體基因的表達量平衡則需要雌性與雄性中的X染色體上調(diào)（XCU）來實現(xiàn)，在晚期胚胎單細胞中活躍的那條X染色體（雄性細胞中僅含一條X染色體，處于活躍狀態(tài)；雌性細胞則含有一條活躍的X染色體和一條失活的X染色體）需要上調(diào)表達劑量兩倍，達到跟同一個細胞中每個常染色體兩個拷貝同樣的表達劑量（X染色體/常染色體的表達劑量比從1：2上調(diào)到2：2）。

該研究發(fā)現(xiàn)X染色體上調(diào)在著床階段的雌性和雄性胚胎細胞中均已經(jīng)啟動，但是還沒有達到上調(diào)兩倍表達劑量的完成狀態(tài)。此外，研究者們還發(fā)現(xiàn)圍著床時期胚胎還存在著一定程度的拷貝數(shù)變異（CNV），且拷貝數(shù)變異并未影響主要譜系的整體基因表達特征。

5. 譜系特異性DNA甲基化動態(tài)變化規(guī)律

為進一步分析胚胎著床過程中的基因組甲基化特征，研究者們利用該團隊創(chuàng)建的單細胞多組學測序技術(shù)對三類細胞譜系的基因組甲基化過程進行了深度分析。圍著床階段胚胎細胞在DNA甲基化特征水平分布成4個主要細胞群體：囊胚期（day 6）上胚層/原始內(nèi)胚層/滋養(yǎng)外胚層、著床后時期（day8/10）上胚層、著床后時期（day8-12）原始內(nèi)胚層、以及著床后時期（day8-12）滋養(yǎng)外胚層。該結(jié)果說明三類細胞譜系在囊胚發(fā)育階段（著床前）具有相似的DNA甲基化模式，在著床后迅速獲得了各自獨特的DNA甲基化特征。

接下來，研究者重點關(guān)注三個細胞譜系各自的DNA甲基化動力學變化過程?？傮w來說，上胚層、原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)外胚層在囊胚發(fā)育階段后基因組均發(fā)生了重新甲基化（圖8），表明胚胎在著床過程中可能經(jīng)歷了表觀遺傳調(diào)控的自我構(gòu)建過程。其中上胚層的DNA甲基化水平從囊胚的26.1%（day6）顯著增加到著床后胚胎的60.0%（day10）。同樣， 滋養(yǎng)外胚層群體的DNA甲基化水平也在囊胚階段（day6）從23.5%上升到著床后胚胎（day10）的46.3%。滋養(yǎng)外胚層群體的DNA甲基化水平顯著低于上胚層譜系（day10），這意味著胚內(nèi)（上胚層）和胚外（滋養(yǎng)外胚層）譜系細胞的表觀遺傳調(diào)控過程可能存在較大差異。

出乎意料的是，囊胚期原始內(nèi)胚層的DNA甲基化水平（27.0%）與上胚層相當（26.1%），第8天上升至33.2%（上胚層為49.9%），第10天略有上升至36.8% （上胚層為60.0%）。與上胚層相比，來自內(nèi)細胞團的另一個譜系原始內(nèi)胚層在著床過程中意外地呈現(xiàn)出非常緩慢的DNA甲基化動力學特征（圖）。

這些數(shù)據(jù)表明，著床后早期胚胎在囊胚期后很快起始了大規(guī)模DNA甲基化過程，三個主要譜系不僅表現(xiàn)出不同的基因表達特征，而且在DNA重甲基化特征呈現(xiàn)不同步的明顯差異。這表明DNA甲基化可能在維持特定細胞譜系的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。因此，這也暗示在著床過程中的調(diào)控各個細胞譜系發(fā)育的表觀遺傳學特征也存在差異。

有趣的是，不同譜系間差異DNA甲基化基因分析表明，各個譜系在胚胎第10天都攜帶特異性DNA甲基化。例如，多能性基因POU5F1和NANOG在第8天滋養(yǎng)外胚層細胞中被特異性甲基化，而上胚層和原始內(nèi)胚層細胞則沒有。相反，滋養(yǎng)外胚層發(fā)育基因如MMP26和PSG7在上胚層和原始內(nèi)胚層細胞中特異性甲基化，但在第8天滋養(yǎng)外胚層細胞中卻維持著低甲基化的狀態(tài) ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 21,22。相比之下，在第8天，原始內(nèi)胚層標記基因如APOA1和CPN1在上胚層和滋養(yǎng)外胚層細胞中特異性甲基化，而在原始內(nèi)胚層細胞中沒有被甲基化（圖7）23,24。這些結(jié)果表明，DNA甲基化在著床后早期的時間窗口內(nèi)可能參與特異性調(diào)控了關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，與基因轉(zhuǎn)錄共同協(xié)調(diào)決定了不同細胞譜系的發(fā)育潛能特化過程。

三類主要譜系在圍著床發(fā)育時期的DNA甲基化水平動態(tài)變化過程

討論

綜上，本研究提供的單細胞分辨率的轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組數(shù)據(jù)對于研究早期人類胚胎發(fā)育研究具有潛在的重要價值。此外，盡管仍不清楚體內(nèi)和體外胚胎發(fā)育之間存在著的具體差異，但本研究提供的數(shù)據(jù)資源可能為優(yōu)化模擬體外著床策略提供直接線索與幫助，這也為多能干細胞的分化與發(fā)育相關(guān)研究提供重要線索和依據(jù)。

北京大學生命科學學院博士后周帆博士、博士生汪睿、北京大學第三醫(yī)院博士生袁鵬、博士生任一昕和北京大學生命科學學院博士生毛雨諾為該論文的并列第一作者，北京大學北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心/生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心湯富酬教授和北京大學第三醫(yī)院喬杰教授為論文的共同通訊作者。該課題得到了北京大學生命科學儀器中心（成像平臺）和北京大學高精尖中心高通量測序平臺的協(xié)助與支持。

原文標題：

Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1500-0

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