深圳子科生物報(bào)道：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院趙凱研究員在國(guó)際期刊Scientific Reports在線發(fā)表了題為“A novel emulsion PCR method coupled with fluorescence spectrophotometry for simultaneous qualitative, quantitative and high-throughput detection of multiple DNA targets ”的研究論文。

近年來核酸檢測(cè)的生物樣本量越來越大，而且往往需要定量和高通量檢測(cè)。傳統(tǒng)生物樣本定性、定量PCR檢測(cè)技術(shù)每次只能對(duì)單個(gè)的基因進(jìn)行檢測(cè)，而對(duì)于生物樣本中的成分不明確多靶基因的檢測(cè)，需要通過多種檢測(cè)方法、進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)才能確定，周期長(zhǎng)，工作量大，成本高。
為了解決這一問題，趙凱研究員在世界上首次提出基于微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法的多靶基因同時(shí)定性、定量和高通量快速檢測(cè)理論：不同熒光基團(tuán)具有不同的波長(zhǎng)，用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記不同基因的特異性引物，通過微滴PCR進(jìn)行擴(kuò)增，不同的PCR產(chǎn)物被不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記，擴(kuò)增結(jié)束后，在用PCR清潔試劑盒去除多余的引物后，通過多功能酶標(biāo)儀熒光掃描，根據(jù)波長(zhǎng)可以對(duì)基因進(jìn)行定性,通過對(duì)熒光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)定量。由于同一個(gè)PCR管中多種不同基因由不同熒光標(biāo)識(shí)，因而可以同時(shí)檢測(cè)多種靶基因，進(jìn)而可以進(jìn)行高通量檢測(cè)。
趙凱研究員首次將微滴PCR與熒光分光光度法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)針對(duì)多靶基因進(jìn)行定性、定量和高通量檢測(cè)的新方法，這是一項(xiàng)國(guó)際相關(guān)領(lǐng)域突破性的創(chuàng)新技術(shù)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
趙凱研究員對(duì)多靶基因定性、定量、高通量檢測(cè)技術(shù)做了大量探索，巧妙地將微滴PCR技術(shù)與熒光分光光度法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)針對(duì)四種靶基因的定性、定量和高通量檢測(cè)。而后，以食源性病原微生物為實(shí)驗(yàn)材料，開展了一種基于微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法的沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的定性、定量和高通量檢測(cè)技術(shù)研究。通過對(duì)空白對(duì)照熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析建立了四種病原菌陽(yáng)性樣品判斷標(biāo)準(zhǔn)-閾值。特異性實(shí)驗(yàn)表明，沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的擴(kuò)增熒光強(qiáng)度值均大于閾值，顯示為陽(yáng)性，與其它細(xì)菌無交叉反應(yīng)。特異性很好。

同時(shí)，他們建立了檢測(cè)四種病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，同時(shí)檢測(cè)四種病原菌的檢測(cè)限均為103拷貝（由于目前沒有專用配套的熒光檢測(cè)儀器，使用的不配套的熒光檢測(cè)儀靈敏度較低。因而檢測(cè)的靈敏度較低。），且R2均大于0.999，線性關(guān)系良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，批內(nèi)變異系數(shù)都在3%以內(nèi)，說明本研究中建立的實(shí)驗(yàn)方法是穩(wěn)定可靠的，批間的變異系數(shù)都在12%以內(nèi)，同樣說明了研究中建立的實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性很好。因此，這一實(shí)驗(yàn)方法可快速、靈敏地檢測(cè)沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，適用于常見食源性病原菌的定性、定量和高通量檢測(cè)。又以4種轉(zhuǎn)基因玉米為材料進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與4種食源性病原菌的檢測(cè)結(jié)果類似，同樣驗(yàn)證了這一理論。
微滴PCR技術(shù)的采用提高了特異性和反應(yīng)的通量，同時(shí)具有高靈敏度。熒光分光光度法采用Thermo VarioSkan Flash多功能酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)了對(duì)產(chǎn)物基于熒光的定性、定量和高通量檢測(cè)。研究采用的引物熒光標(biāo)記法對(duì)PCR產(chǎn)物的大小和序列沒有要求，是根據(jù)標(biāo)記的熒光基團(tuán)進(jìn)行識(shí)別的，只要引物特異性好，靶基因能特異性擴(kuò)增，微滴PCR產(chǎn)物就能識(shí)別出來。這對(duì)于DNA序列同源性很高，保守區(qū)很短的多種基因同時(shí)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)尤為明顯。采用熒光酶標(biāo)儀對(duì)引物熒光標(biāo)記的微滴PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)非?？焖伲瑱z測(cè)一種基因只需1秒鐘時(shí)間。
Thermo VarioSkan Flash多功能酶標(biāo)儀的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為200-100nm，適當(dāng)調(diào)整激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，可同時(shí)檢測(cè)20種熒光標(biāo)記物，使用384孔酶標(biāo)板，則一次可檢測(cè)6000多種基因。這一方法提高了目標(biāo)擴(kuò)增的通量，同時(shí)減少了寶貴的試劑和樣品的消耗，具有快速，方便，成本低廉，易于推廣，環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)，可用于所有生物樣品中多靶核酸的同時(shí)定性、定量和高通量檢測(cè)。
該論文共同第一作者為上海師范大學(xué)杜亞楠碩士和寧夏大學(xué)趙笑碩士。上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院趙凱研究員為該論文的通訊作者。該研究得到了上海市科委科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目和閔行區(qū)科委產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目的支持。
趙凱研究員自2000年起就致力于生物檢測(cè)試劑盒的研發(fā)，現(xiàn)已開發(fā)出20余個(gè)檢測(cè)試劑盒，涉及ELISA、金標(biāo)試紙條、常規(guī)PCR、熒光定量PCR、多重PCR、微滴PCR、LAMP、RPA等領(lǐng)域。目前聚焦于檢測(cè)方法學(xué)研究。近年來在國(guó)際相關(guān)領(lǐng)域前沿期刊Scientific Reports 、PlOS ONE、Regulatory Toxicology and Pharmacology,、Archives of Virology、Virology Journal、Journal of Cereal Science等期刊上發(fā)表了多篇重要文章。

目前專利已經(jīng)授權(quán)：一種基于多重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量檢測(cè)方法（ZL201410022452.X）。

原文檢索：

A novel emulsion PCR method coupled with fluorescence spectrophotometry for simultaneous qualitative, quantitative and high-throughput detection of multiple DNA targets. Scientific Reports, (2019) 9:184, DOI:10.1038/s41598-018-36981-1