子科生物報道：膽道閉鎖（biliary atresia, BA）在新生兒期發(fā)病，是免疫介導(dǎo)的肝外和/或肝內(nèi)膽管阻塞，導(dǎo)致病理性黃疸以及肝硬化和肝衰竭等嚴重危及嬰幼兒生命的疾病。BA在我國兒童中的發(fā)病率約為1/8,000，與兒童期各種腫瘤發(fā)病率之和相當(dāng)。BA確診后需立即行肝門腸吻合術(shù)（葛西手術(shù)）以疏通膽汁流。多數(shù)未行葛西術(shù)手術(shù)的患兒在一年內(nèi)就會發(fā)展成終末期肝硬化和肝功能衰竭。葛西術(shù)后超過一半的患兒也需進行肝移植手術(shù)以挽救生命，很多自肝生存患兒長期受累于反復(fù)膽管炎癥、門靜脈高壓、食管靜脈曲張性出血、肝性骨營養(yǎng)不良等癥狀。雖然動物實驗和臨床觀察提示圍產(chǎn)期/新生兒病毒感染引發(fā)的自身免疫性肝損傷是BA發(fā)病的重要機制，但導(dǎo)致肝硬化和肝衰竭的免疫病理機制以及靶向干預(yù)方案仍待闡述。

2020年11月27日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生命科學(xué)學(xué)院的白凡研究員團隊與廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒科研究所的張玉霞教授團隊、該中心外科實驗室的溫哲教授、夏慧敏教授團隊合作在Cell雜志以研究長文的形式發(fā)表題為 Liver immune profiling reveals pathogenesis and therapeutics for biliary atresia 的研究論文。該工作以臨床隊列為研究對象、借助單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、動物及臨床試驗，系統(tǒng)描繪了BA患兒肝臟免疫圖譜，提出B細胞耐受缺陷、殺傷性T細胞擴增、巨噬細胞低炎反應(yīng)性、Kupffer細胞清道夫功能障礙、組織修復(fù)性CX3CR1+T/NK細胞的缺乏共同促進了BA患兒的肝硬化和肝衰竭進展。尤其值得強調(diào)的是，團隊首次報道新生兒肝臟存在完整的B細胞造血功能，（病毒感染后）因B細胞耐受缺陷產(chǎn)生了大量的自身反應(yīng)性IgG抗體。在一項探索性臨床試驗中，用利妥昔單抗（Rituximab）對4例BA患兒的B細胞進行了清除性治療，發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗治療后BA患兒肝臟紊亂的免疫系統(tǒng)恢復(fù)到了健康狀態(tài)。

隊列特征與肝臟免疫圖譜
團隊對一萬多份臨床病例（健康對照2471份、生理性黃疸9297份、膽總管囊腫248份、膽道閉鎖（BA）927份）進行了回顧性分析，證實BA患兒存在持續(xù)性肝損傷。為闡述免疫病理機制，該研究對6例BA患兒的肝活檢組織，以及10例對照肝組織進行了單細胞測序，并對T細胞和B細胞進行了V（D）J測序，最終定義了42個免疫細胞亞群，發(fā)現(xiàn)與肝硬化和肝衰竭相關(guān)的如下免疫功能失調(diào)：

BA嬰兒肝臟中細胞毒細胞擴增，Th17-Th1轉(zhuǎn)分化加強

研究發(fā)現(xiàn)具有細胞毒性的cTh1和兼具Th17和Th1特征 ex-cTh17在BA患兒肝臟中顯著增加，TCR分析發(fā)現(xiàn)BA患者肝臟內(nèi)ex-cTh17和 cTh1之間的轉(zhuǎn)分化加劇。ex-cTh17和cTh1都具有高細胞毒性、 促纖維化以及高趨化性等特征。除CD4 T細胞外，γδ T17和MAIT17也表現(xiàn)出Th1特征（TBX21+ STAT4+ EOMES+ IFN-γhi），這說明BA患兒肝臟微環(huán)境的改變會促進Th17向Th1的轉(zhuǎn)分化。BA患者肝臟內(nèi)高細胞毒性的CD8Trm比例及克隆擴增顯著增加， CX3CR1+CD8Teff到CD8Trm的轉(zhuǎn)分化顯著增多，具有免疫保護以及抑制成纖維作用的CX3CR1+ CD8Teff細胞比例及其CX3CR1表達量顯著降低。

B細胞淋巴細胞生成和耐受缺陷促進自身反應(yīng)性B細胞的擴增

一直以來都認為肝臟中的血細胞生成發(fā)生在人類胎肝中，出生后已經(jīng)停止。出乎意料的是研究者發(fā)現(xiàn)B細胞淋巴細胞生成過程在出生后的嬰兒肝臟中仍完好無損 （造血干細胞、pre-pro-B、pro-B、pre-B、immature B、Transitional B、na?ve B、memory B （CD27- 和 CD27+）、漿母細胞和漿細胞（圖2A-B）。運用Bulk RNAseq的方法發(fā)現(xiàn)在肝臟和骨髓中，對應(yīng)的B細胞在其各自的發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄譜幾乎相同。流式和免疫熒光染色也顯示B細胞前體細胞（RAG1/2+CD10+）在肝臟的存在（圖2C-D）。此外，盡管發(fā)育中的CD10+ B細胞的比率隨著年齡增長而下降，但至少在出生后的4個月內(nèi)仍持續(xù)著B細胞生成。對人類骨髓B細胞的研究表明，大多數(shù)前體細胞和未成熟B細胞具有自身反應(yīng)性B細胞受體（BCR）。這些B細胞出骨髓到外周系統(tǒng)需要清除高自身親和力的BCR，這一過程被稱為中樞耐受【1】。研究者認為肝臟B細胞的耐受性缺失可能是導(dǎo)致BA肝臟損傷的重要原因。通過一系列分析，發(fā)現(xiàn)BA患兒的記憶 B細胞、漿母細胞和漿細胞的BCR具有自身反應(yīng)性的特征，并且它們的Ig 類型轉(zhuǎn)換也明顯受到抑制。通過免疫球蛋白濃度的測量證實BA患者肝臟具有保護性質(zhì)的 IgM特異性自身抗體濃度降低，而具有損傷作用的IgG特異性自身抗體濃度升高，并且患者無黃疸的存活時間與IgM/IgG4比值有正相關(guān)關(guān)系。

膽汁酸淤積抑制肝臟巨噬細胞炎癥反應(yīng)和Kupffer細胞吞噬功能

研究者通過單細胞轉(zhuǎn)錄組以及實驗室檢測比較肝活檢樣本勻漿中細胞因子的濃度，發(fā)現(xiàn)BA患者肝內(nèi)髓系細胞的炎癥反應(yīng)和趨化作用被明顯抑制（圖3D 和F），此外，BA患者Kupffer的清道夫功能顯著受損 。已有的報道顯示膽汁酸通過細胞表面受體TGR5（由GPBAR1編碼）以環(huán)狀A(yù)MP（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）依賴性方式抑制巨噬細胞的炎癥、趨化性和吞噬功能，因此研究者探討了膽汁酸在BA患兒肝臟髓系細胞功能障礙產(chǎn)生中的貢獻 。通過表達相關(guān)性分析，研究者證實GPBAR1表達與cAMP信號傳導(dǎo)正相關(guān)，這導(dǎo)致炎癥基因的表達抑制 。因此，BA肝臟髓系細胞的低炎癥狀態(tài)可能是由膽汁酸在肝臟的積累導(dǎo)致的。

CX3CL1-CX3CR1纖維化控制機制失調(diào)

肝星狀細胞分泌趨化因子CX3CL1介導(dǎo)CX3CR1+淋巴細胞、Kupffer以及單核巨噬細胞的募集和粘附。Cx3cr1缺失的小鼠分泌大量的TNF-α和TGF-β，從而激活肝星狀細胞并促進纖維化。共培養(yǎng)實驗驗證了CX3CR1+ CD8Teff細胞可抑制肝星狀細胞系（LX-2細胞）促纖維化基因的表達。因此BA患者肝內(nèi)CX3CR1+ CD8Teff的缺乏可促進肝纖維化的進程。

CX3CR1+循環(huán)NK細胞（cir-NK）和循環(huán)NKT細胞（cir-NKT）在BA患兒肝臟內(nèi)的比率也顯著降低。CX3CR1+ T和NK細胞都高表達編碼促進細胞遷移以及與非淋巴細胞相互作用的基因；轉(zhuǎn)錄因子分析揭示CX3CR1+ T和NK細胞內(nèi)兼具有高ASCL2和KLF2的轉(zhuǎn)錄活性，且它們的靶基因富集在參與細胞遷移和膠原結(jié)合的通路上。實驗證實ASCL2可結(jié)合在KLF2的啟動子，而KLF2可結(jié)合在CX3CR1的啟動子(圖4F)，提示ASCL2-KLF2-CX3CR1軸調(diào)控CX3CR1+T和NK細胞CX3CR1的表達和功能。此外，BA患者肝臟內(nèi)CX3CL1的濃度顯著降低 。這些發(fā)現(xiàn)都提示在BA肝臟中具有抑制肝臟纖維化作用的CX3CR1+CD8Teff和NK細胞減少可能與細胞本身趨化能力降低以及肝臟趨化因子減少有關(guān)。在小鼠模型中也證實了這一發(fā)現(xiàn)。關(guān)于肝臟中CX3CR1+T和NK細胞如何參與肝臟纖維化的調(diào)節(jié)，本研究也進行了初步的探討，認為Granzyme B參與介導(dǎo)了CX3CR1+T和NK細胞對成纖維細胞的殺傷 。

B細胞修飾療法治療BA的初步探討

除了產(chǎn)生自身抗體外，B細胞還可以通過MHC介導(dǎo)的抗原呈遞或可溶性介質(zhì)來修飾T，NK和髓系細胞的功能，據(jù)此推測B細胞修飾療法可以緩解BA的肝損傷。通過RRV誘導(dǎo)的BA疾病鼠模型研究發(fā)現(xiàn)與未治療的RRV小鼠相比，anti-CD20抗體組（清除成熟B細胞），或anti-MHC I和II組（阻斷MHC-I或II介導(dǎo)的抗原呈遞），可顯著增加體重并減少黃疸發(fā)生。除此之外，B細胞修飾療法組的BA鼠肝內(nèi)Cx3cl1和C1q的濃度顯著升高、Kuppfer細胞的數(shù)目及其清道夫功能得到恢復(fù)、肝臟內(nèi)的淋巴細胞浸潤降低、肝纖維化程度得到緩解。鑒于BA小鼠模型中顯示的功效，研究者進一步探索了抗CD20治療對BA患兒的治療作用。

研究團隊在試驗性臨床研究中招募了4名BA患兒進行治療。發(fā)現(xiàn)單劑RTX（利妥昔單抗，anti-CD20）是安全的。在使用RTX一天后，外周血和肝來源的成熟B細胞被有效清除，在使用RTX 2-3個月后，B細胞恢復(fù)正常水平。與未經(jīng)RTX治療的14名BA患者相比，RTX治療后4名試驗受試者中自身抗體濃度降低 。研究者對3位接受RTX治療的BA患者的肝活檢樣本進行了scRNA-seq測序，發(fā)現(xiàn)CD20+ B細胞被清除，而不表達CD20的B細胞前體細胞RAG1/2 + B細胞和成熟的漿細胞PC并未受到明顯影響 。此外，RTX的使用降低了BA肝臟中CD8Trm細胞的比例和克隆擴增， CX3CR1+ CD8Teff和CD8Trm之間的轉(zhuǎn)分化也明顯減少 。轉(zhuǎn)錄組比較分析發(fā)現(xiàn)使用RTX的患者CX3CR1+ CD8Teff細胞中CX3CR1和GZMA/B表達增強、CD8Trm細胞中的IFNG表達降低、單核巨噬細胞的炎癥反應(yīng)性和清道夫功能以及cTh17細胞中Th17特征基因的表達增高?？偟膩碚f，短暫的B細胞清除可能可以作為恢復(fù)BA嬰兒肝免疫穩(wěn)態(tài)的術(shù)前或術(shù)后策略 。

這項研究不僅提供了較為全面的導(dǎo)致BA患兒肝臟快速衰竭的免疫致病機制，同時提出B細胞修飾療法可以改善BA患兒的肝臟病理。北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生命科學(xué)學(xué)院白凡研究員，廣州市婦女兒童醫(yī)療中心的張玉霞教授、溫哲教授、夏慧敏教授是本文的共同通訊作者。廣州市婦女兒童醫(yī)療中心的王俊副研究員、徐艷慧博士、北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心的陳章華博士生、廣州市婦女兒童醫(yī)療中心外科的梁鑒坤博士、林澤峰博士以及梁會營主任是本文的共同第一作者。