子科生物報(bào)道：　2021年2月8日，《Development》期刊在線發(fā)表了中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心、神經(jīng)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉志勇研究組題為《嵌合CRISPR-stop技術(shù)實(shí)現(xiàn)核心基因突變的快速表型分析》的研究論文。
　　小鼠和人類的聽覺系統(tǒng)在發(fā)育和功能上十分相似，因此，利用小鼠模型篩查耳蝸聽覺毛細(xì)胞發(fā)育過程中的重要基因?qū)τ诿?xì)胞再生和臨床上尋找耳聾基因的治療靶點(diǎn)有重要的意義。雖然目前耳蝸毛細(xì)胞在幼年和成年不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析已有報(bào)道，但是至今為止，我們對(duì)于毛細(xì)胞分化成熟的分子機(jī)制還知之甚少。其中一個(gè)主要的原因是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的小鼠模型構(gòu)建費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通常需要首先構(gòu)建F0代小鼠，然后進(jìn)行生殖細(xì)胞傳代，獲得遺傳穩(wěn)定的F1小鼠之后再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

　　為了快速進(jìn)行突變基因的表型篩查，劉志勇研究組于2018年建立了直接在F0代小鼠中同時(shí)敲除三個(gè)非致死基因的方法。但是，小鼠約25%的基因純合突變會(huì)導(dǎo)致早期胚胎流產(chǎn)或者出生后致死，導(dǎo)致之前的策略并不適用致死基因的突變篩查。解決這個(gè)問題的常規(guī)策略是利用Cre/Loxp系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因突變，但是更加費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

　　如何加速致死基因的表型分析呢？本研究首次嘗試在小鼠2細(xì)胞期卵裂球的1個(gè)細(xì)胞內(nèi)注射單堿基編輯元件和基因特異性的sgRNA，產(chǎn)生嵌合體突變的小鼠，即在該小鼠各個(gè)器官內(nèi)，野生型（沒有基因編輯的細(xì)胞后代）和純合突變型（經(jīng)過基因編輯的細(xì)胞后代）的細(xì)胞交錯(cuò)分布，這種方法因此被命名為MosaicCRISPR-stop。

　　該研究首先利用Atoh1基因來檢測(cè)方法的可行性。Atoh1 -/- 小鼠不能產(chǎn)生耳蝸毛細(xì)胞且出生后由于呼吸節(jié)律紊亂而致死。結(jié)果顯示，利用Mosaic CRISPR-stop方法產(chǎn)生的Atoh1突變小鼠的耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量顯著減少且該小鼠可以存活到成年。 　　  　　

　　隨后，致死基因Sox10突變耳蝸長(zhǎng)度縮短的表型也可以被Mosaic CRISPR-stop方法重現(xiàn)。

　　最后，該研究利用此方法探索了Rbm24基因（其突變導(dǎo)致心臟異常和胚胎期死亡）的功能。Rbm24在耳蝸毛細(xì)胞高峰度表達(dá)，但其功能還完全未知。

　　利用Mosaic CRISPR-stop方法，作者在8周內(nèi)快速鑒定出了Rbm24 -/-嵌合小鼠耳蝸的表型為毛細(xì)胞大量死亡，這表明Rbm24對(duì)于毛細(xì)胞的存活發(fā)揮了重要的功能。這個(gè)表型也可以被傳統(tǒng)的Rbm24條件性敲除小鼠模型所重復(fù)。 　　   

　　值得強(qiáng)調(diào)的是：Mosaic CRISPR-stop研究方法不僅適用于聽覺系統(tǒng)，也適用于其他器官組織，具有很高的普適性，可以大大加速發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域鑒定基因功能的速度。

　　該工作由中科院腦智卓越中心聽覺系統(tǒng)發(fā)育再生研究組劉志勇研究員指導(dǎo)，主要由博士研究生王廣琴與博士后李超共同完成，研究組的賀順姬也做出了重要貢獻(xiàn)。該研究中的共聚焦成像相關(guān)工作在中科院腦智卓越中心所級(jí)中心的光學(xué)成像平臺(tái)完成，楊輝研究組提供了顯微注射儀器，動(dòng)物房劉倩在胚胎移植實(shí)驗(yàn)中提供了很大幫助。本工作得到中科院、科技部、基金委的基金資助。