子科生物報(bào)道：胃癌全球范圍內(nèi)致死率排名第三，患者通常只有不到40%的五年生存率。其中約10%的胃癌與EB病毒（EBV）相關(guān)。相比于EBV陰性胃癌，EBV陽性胃癌（EBV associated gastric carcinomas，EBVaGCs）具有獨(dú)特的分子特征，包括PIK3CA高頻突變、CDKN2A表達(dá)缺失、高甲基化，以及9p24.1擴(kuò)增等，表明EBV在EBVaGCs的腫瘤發(fā)生過程中可能扮演著重要角色。有研究提出，癌癥惡化前的遺傳變化與EBV感染有關(guān)。然而，EBVaGCs腫瘤發(fā)生的分子時(shí)序以及介導(dǎo)其發(fā)展的驅(qū)動(dòng)事件仍待闡述。

2021年9月8日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）白凡研究員課題組與中山大學(xué)腫瘤防治中心鐘茜課題組合作在Genome Medicine雜志以研究長文的形式發(fā)表題為"The genomic architecture of EBV and infected gastric tissue from precursor lesions to carcinoma"的論文。該研究對來自于25個(gè)EBVaGCs患者的123個(gè)樣本（包含了唾液、組織形態(tài)正常的胃黏膜組織、癌前病變以及腫瘤等多種類型）進(jìn)行了全外顯子組測序，EBV基因組測序以及甲基化測序（圖1），從而對EBVaGCs發(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞與EB病毒的基因組特征進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。

圖1. 研究方法展示

通過全外顯子測序，研究者發(fā)現(xiàn)EBVaGCs和癌前病變中的重度不典型增生（high-grade dysplasia，HD）相比正常胃粘膜組織和輕度不典型增生（low-grade dysplasia，LD）具有更高的體細(xì)胞突變頻率。EBVaGCs中具有高頻突變的基因主要富集在PI3K-Akt、染色質(zhì)相關(guān)通路、細(xì)胞周期調(diào)控、Wnt和Notch通路，包括PIK3CA、PTEN、ARID1A、SMAD4、CTNNB1和NOTCH1等基因，其中PIK3CA和ARID1A在腫瘤中的突變頻率高于其在癌前病變的突變頻率（圖2）。另一方面，相比癌前病變，PI3K-Akt、RTK和JAK通路相關(guān)的驅(qū)動(dòng)基因拷貝數(shù)在EBVaGCs中明顯增加；然而染色質(zhì)相關(guān)信號通路或Notch通路相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因的拷貝數(shù)缺失事件則在癌前病變和腫瘤中具有類似的發(fā)生頻率，這也表明在腫瘤發(fā)展過程中，拷貝數(shù)缺失傾向于發(fā)生在早期，而致癌基因的擴(kuò)增更可能發(fā)生在后期。

圖2. EBVaGCs和癌前病變組織中的體細(xì)胞突變頻率比較

研究者進(jìn)一步對隊(duì)列中每個(gè)患者的所有癌前病變與腫瘤樣本進(jìn)行了克隆分析，并通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)每個(gè)患者的EBVaGCs均為單克隆來源，并且所有HDs都與EBVaGCs具有相同的來源（圖3）。

圖3.一個(gè)典型病人的EBVaGCs與癌前病變組織的克隆進(jìn)化關(guān)系

研究者進(jìn)一步對EBV基因組進(jìn)行了分析。首先發(fā)現(xiàn)了EBVaGCs和HD中EBV的基因組拷貝數(shù)顯著高于正常胃黏膜組織和LD，表明EBV在癌前病變HD階段即發(fā)生了大量的擴(kuò)增。通過構(gòu)建病毒基因組的系統(tǒng)發(fā)育樹，研究者發(fā)現(xiàn)每個(gè)患者中EBVaGCs和HD的EBV序列高度一致，但是和正常組織以及LD中的EBV序列具有明顯差異。另外，患者唾液中的EBV序列與EBVaGCs中病毒序列也明顯不一致，但是和正常胃黏膜組織以及LD中的EBV序列較為相似。進(jìn)一步，研究者發(fā)現(xiàn)正常胃黏膜組織和LD的EBV基因組相比EBVaGCs/HD中的EBV具有更高比例的雜合性單核苷酸突變（SNVs）。這可能是正常組織和LD存在混合毒株或者不同毒株間的重組導(dǎo)致的，而EBVaGCs和HD中低比例的雜合性SNVs則進(jìn)一步證明了它們具有單株來源的EBV。唾液、正常胃黏膜組織以及LD和EBVaGCs/HD中的EBV序列的多樣性也暗示了在腫瘤發(fā)展過程中EBV毒株受到了特異性選擇。

高甲基化是EBVaGCs的一個(gè)顯著的分子特征，有報(bào)道稱EBV基因組中的LMP2A可以通過激活DNMT1和DNMT3B而導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因組發(fā)生高甲基化。研究者通過全基因組甲基化測序，發(fā)現(xiàn)正常胃黏膜組織和LD的甲基化譜較為相似，但兩者與EBVaGCs有顯著差異。相對于正常組織/LD，EBVaGCs中存在6316個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMRs)，其中99.8%處于高甲基化狀態(tài)。在所有高甲基化區(qū)域里，66.44%與啟動(dòng)子區(qū)域重疊?；蛲犯患治鲲@示這些區(qū)域包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和Wnt通路的負(fù)調(diào)控基因。研究人員發(fā)現(xiàn)，相比于癌前病變以及其他類型的胃癌，EBVaGCs中RasGTPase激活蛋白（RasGAP）家族的一些基因（包括RASA3、RASA4、RASAL3等）啟動(dòng)子區(qū)域均為高甲基化狀態(tài)，提示這些基因表達(dá)沉默可能會促進(jìn)Ras的激活從而激活下游PI3K-Akt通路，以進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)展（圖4）。為了證實(shí)這一觀點(diǎn)，研究人員比較了胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS在EBV感染前后RasGAP家族基因的甲基化和表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)EBV感染之后RasGAP家族基因呈現(xiàn)出高甲基化、低mRNA水平等特征，RAS通路活性也隨之升高；而通過使用甲基化抑制劑5-aza，則可以削弱上述效應(yīng)。

圖4. EBVaGC與癌前病變組織中的甲基化程度對比；EBV感染后RasGAP家族基因mRNA水平降低，RAS通路活性升高

通過整合腫瘤發(fā)展過程中不同階段的分子事件，研究者發(fā)現(xiàn)EBVaGCs和HD具有高頻的PI3K-Akt通路基因（PIK3CA/B、PTEN）、Wnt通路基因(CTNNB1、GNAS)和ARID1A的突變以及拷貝數(shù)變異，而這些變異事件在正常胃黏膜組織和LD中較為罕見。結(jié)合PI3K-AKt和Wnt通路上游負(fù)調(diào)控因子啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化特征，研究者推測PI3K-Akt和Wnt通路的異常共同激活了EBVaGCs和HD中被EBV感染的細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。為了證明上述結(jié)論，研究者結(jié)合一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)PI3K抑制劑和Wnt通路抑制劑對具有PIK3CA和CTNNB1雙突變的腫瘤細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用（圖5），揭示了同時(shí)使用這兩種通路的抑制劑可以作為EBVaGCs的一種潛在治療策略。另外，通過研究EBVaGCs中宿主細(xì)胞和EB病毒的基因組特征和分子時(shí)序，也為針對這一特殊類型的胃癌病人進(jìn)行精準(zhǔn)治療提供了理論依據(jù)。

圖5. EBVaGC驅(qū)動(dòng)事件與克隆演化模型總結(jié)；細(xì)胞與小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)PI3K抑制劑和Wnt通路抑制劑對具有PIK3CA和CTNNB1雙突變的腫瘤細(xì)胞具有顯著協(xié)同抑制作用

北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心陳章華博士，陳西茜博士，中山大學(xué)腫瘤防治中心顏淑梅醫(yī)生、張琦醫(yī)生、劉尚鑫博士研究生為本文的并列第一作者。北京大學(xué)BIOPIC白凡，中山大學(xué)腫瘤防治中心鐘茜研究員為該研究論文的共同通訊作者。中山大學(xué)腫瘤防治中心曾木圣教授為本研究提供了重要指導(dǎo)。該研究項(xiàng)目得到了來自國家自然科學(xué)基金委、科技部、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目的支持。