?子科生物報道：復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院彭勃課題組、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院毛穎課題組和上海市精神衛(wèi)生中心袁逖飛課題組的研究人員開展的聯(lián)合攻關(guān)，利用活細胞成像、嚴謹譜系追蹤和藥理學(xué)等多個手段對NeuroD1介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程現(xiàn)象進行了系統(tǒng)性探索。2021年12月6日，相關(guān)研究成果以NeuroD1 induces microglial apoptosis and cannot induce microglia-to-neuron cross-lineage reprogramming為題，發(fā)表在神經(jīng)科學(xué)頂級期刊《神經(jīng)元》（Neuron）上（圖1）。

圖1 論文首頁

小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程的構(gòu)想

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞組成。與外周組織器官不同，成年后哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元幾乎不能再生。在神經(jīng)退行性病變中（如阿爾茲海默病、帕金森病、亨廷頓病和腦中風(fēng)等），神經(jīng)元會大量死亡。死亡的神經(jīng)元無法再生，從而造成不可逆的嚴重腦功能損傷。與靜態(tài)的神經(jīng)元不同，膠質(zhì)細胞具有一定的再生能力。研究人員提出通過病毒工具操控某個分子，誘導(dǎo)膠質(zhì)細胞發(fā)生重編程（reprogramming；或轉(zhuǎn)分化：conversion），使其分化成神經(jīng)元，實現(xiàn)神經(jīng)元的原位再生（in situ regeneration）。從而利用一類可再生的細胞（膠質(zhì)細胞）補充損失的不可再生的細胞（神經(jīng)元），實現(xiàn)神經(jīng)退行性病變的治療。膠質(zhì)細胞的重編程現(xiàn)象首先由德國馬克斯·普朗克神經(jīng)生物學(xué)研究所的Magdalena G?tz教授課題組闡述，他們在2002年報告了PAX6可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元2。隨后，一系列研究聚焦在該研究領(lǐng)域，包括德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心張春立課題組 (SOX2，2013)，賓夕法尼亞州立大學(xué)的陳功課題組 (NeuroD1, 2014)3，HHMI的Marius Wernig和Thomas Südhof課題組 (ASCL1, 2014)4等。這些方案均是通過操控單個因子，將星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)元。雖然星形膠質(zhì)細胞能夠再生，但是其再生能力相對較弱（即使在depletion-repopulation條件下，星形膠質(zhì)細胞平均每天僅能再生0.7%）5。因而，研究人員提出能否通過誘導(dǎo)其他再生能力強的膠質(zhì)細胞類型重編程為神經(jīng)元。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)再生能力最強的膠質(zhì)細胞。復(fù)旦大學(xué)彭勃課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞于再殖條件下，能夠通過自我增殖的方式平均每天再生20%的細胞6。若是能通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞重編程，那么將相當(dāng)于發(fā)現(xiàn)了一個無窮無盡的補給源，可用來大量補充受損的神經(jīng)元。來自日本的Kinichi Nakashima課題組，于2019年報道了通過慢病毒異源性表達NeuroD1，可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元7。然而，領(lǐng)域內(nèi)對該現(xiàn)象充滿爭議。主要爭議集中在其原理性上：（1）前人所發(fā)現(xiàn)的星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程，兩類細胞均是來源于神經(jīng)外胚層譜系，由radial glia分化而來，親緣關(guān)系較近，可能會發(fā)生轉(zhuǎn)分化。而小膠質(zhì)細胞是由卵黃囊中的髓系細胞發(fā)育而來，發(fā)育譜系差別很遠。若能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程，則這是一類跨譜系的轉(zhuǎn)變，理論上是難以實現(xiàn)的。（2）前人所發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程的因子（如NeuroD1）均是radial glia分化過程中與細胞命運決定相關(guān)的因子。然而，NeuroD1并不表達在小膠質(zhì)細胞所在的髓系譜系中，跨譜系表達如此重要的先導(dǎo)因子（pioneer factor）能否有相應(yīng)的下游元件支撐神經(jīng)外胚層譜系細胞的命運決定亦存疑。同時，近期還存在關(guān)于NeuroD1介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程是否是實驗假象的重大爭議8。

證明膠質(zhì)細胞重編程的三個基本原則

驚人且重大的結(jié)論必須進行嚴謹?shù)那笞C。在該研究中，研究人員提出了充分證明膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程所需的三個基本原則：（1）通過嚴謹?shù)拿鞔_的（unambiguous）譜系追蹤，設(shè)置合理設(shè)計的對照組（well-designed control）證明，并排除存在病毒泄漏的可能性；（2）通過明確的（unambiguous）活體/活細胞成像證據(jù)，觀察到膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元的轉(zhuǎn)變過程；（3）若是殺掉該類型的膠質(zhì)細胞，那么該因子所介導(dǎo)的膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化將不會發(fā)生。

首先是譜系追蹤，研究人員利用他莫昔芬誘導(dǎo)CX3CR1-CreER::Ai14小鼠的幾乎所有小膠質(zhì)細胞特異性表達tdTomato（永久標(biāo)記，即使細胞命運發(fā)生轉(zhuǎn)變，依然會表達tdTomato）。接下來，通過慢病毒hCAG-NeuroD1-T2A-GFP或hCD68-NeuroD1-T2A-GFP感染小膠質(zhì)細胞。如果小膠質(zhì)細胞表達NeuroD1后能夠重編程為神經(jīng)元，那么將能發(fā)現(xiàn)一批tdTomato+ GFP+神經(jīng)元。然而，該團隊并沒有發(fā)現(xiàn)這群雙熒光標(biāo)記陽性神經(jīng)元的存在（圖2）。為了充分驗證該現(xiàn)象，研究團隊在CX3CR1+/GFP小鼠腦內(nèi)引進CMV-DIO-mCherryforward-(NeuroD1-T2A-GFP)reverse或CMV-DIO-mCherryforward-GFPreverse慢病毒用來感染腦細胞（圖3A）。若是NeuroD1能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程，則能在第一個病毒處理后觀察到GFP+神經(jīng)元，而作為對照組的第二個病毒將觀察不到。然而，不論是通過何種病毒誘導(dǎo)，均能觀察到很高比例的GFP+神經(jīng)元（圖3），說明前人所能觀察到的“小膠質(zhì)細胞起源神經(jīng)元”是來自于實驗假象。理論上，在經(jīng)過他莫昔芬誘導(dǎo)后，病毒僅會在小膠質(zhì)細胞中發(fā)生同源重組，從而表達GFP。但是，研究人員觀察到的現(xiàn)象說明利用病毒工具載體進行感染時，會伴隨有非特異性泄漏的風(fēng)險。非特異性病毒泄漏可能會導(dǎo)致對實驗結(jié)論的誤讀。

圖2 In vivo microglia-specific lineage tracing does not support the microglia-to-neuron conversion.

圖3 Lentivirus induces non-specific labeling in vivo, which may confound the microglia-to-neuron observation.

在觀察小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)變過程方面，研究人員通過活細胞成像方式進行觀察，并沒有發(fā)現(xiàn)表達NeuroD1的小膠質(zhì)細胞發(fā)生到神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變。恰恰相反，研究人員發(fā)現(xiàn)表達NeuroD1后，會引起小膠質(zhì)細胞的大規(guī)模死亡。通過BCL2途徑可以對抗由NeuroD1小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的死亡，說明其NeuroD1不僅不能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞重編程，而會誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的凋亡。這也很好解釋了為何前人和該研究團隊觀察到的“小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元”假象的比例很高（圖3C，>90%）的原因：成功表達NeuroD1的小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)發(fā)生凋亡而死去，因而最后剩下的細胞大都是非特異性泄漏細胞。

最后，研究人員通過CSF1R抑制劑PLX5622殺死腦內(nèi)99%的小膠質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)即使在這種情況下，依然會有很高比例的“小膠質(zhì)細胞起源神經(jīng)元”，且比例與不殺小膠質(zhì)細胞的對照組相當(dāng)（圖4）。因此，研究結(jié)果更加確認了前人所觀察到的“小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程”并非真實情況，而是來自于病毒非特異性泄漏所產(chǎn)生的實驗假象（圖5）。

圖4 Even under microglia depleted brain, the “microglia-converted neurons” are detected, reflecting a lentiviral leakage artifact.

圖5 該研究主要結(jié)論的總結(jié)。

NeuroD1用于防止替換/移植小膠質(zhì)細胞失控的分子開關(guān)

復(fù)旦大學(xué)彭勃團隊利用小膠質(zhì)細胞的再生能力，開發(fā)了三種方案（Mr BMT, Mr PB和Mr MT），首次在全腦尺度上實現(xiàn)小膠質(zhì)細胞的高效外源性移植/替換9-12。該方案可用于治療由小膠質(zhì)細胞突變引起的疾病。然而，細胞移植所面臨的挑戰(zhàn)之一是如何防止外源性細胞失控。在小鼠模型中，常用誘導(dǎo)白喉毒素（DT）表達的方式殺死特性類型的細胞。由于小鼠沒有白喉毒素受體，因而死亡細胞所釋放出的白喉毒素不會殺死鄰近的細胞。然而，由于人類細胞存在白喉毒素受體，因而該方案不能用于臨床實踐。由于NeuroD1可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡，因此該研究團隊提出通過體外改造的方式，在移植/替換的小膠質(zhì)細胞中放入誘導(dǎo)表達NeuroD1的元件。一旦移植/替換的小膠質(zhì)細胞失控，可以通過該分子開關(guān)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡，從而提升小膠質(zhì)細胞替換/移植的安全性。

上海市精神衛(wèi)生中心饒艷霞博士為該論文的第一作者和共同通訊作者。復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院彭勃教授、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院毛穎教授和上海市精神衛(wèi)生中心袁逖飛教授為共同通訊作者。該團隊多人為此研究做出貢獻。