糖尿病腎?。―N）作為糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，一直是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。長(zhǎng)期以來，“腎小球中心論” 主導(dǎo)著 DN 發(fā)病機(jī)制的研究，但越來越多證據(jù)表明，腎小管損傷在 DN 進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，甚至可能先于腎小球病變出現(xiàn)。鐵死亡作為一種鐵依賴的程序性細(xì)胞死亡方式，其在 DN 腎小管損傷中的具體作用及調(diào)控機(jī)制尚不明確。尤其是谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）作為重要的抗氧化酶，其在腎近端小管上皮細(xì)胞（RTECs）中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明。因此，深入探究鐵死亡在 DN 中的作用及相關(guān)調(diào)控通路，對(duì)于尋找新的治療靶點(diǎn)具有迫切的臨床意義。
華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)在《Cell Communication and Signaling》發(fā)表的研究，圍繞 DN 腎小管損傷中的鐵死亡機(jī)制展開系統(tǒng)研究。研究旨在明確鐵死亡在 DN 不同階段的作用、維生素 D 受體（VDR）對(duì) GPX4 的調(diào)控機(jī)制，以及 E3 泛素連接酶 PRPF19 在 VDR 降解中的角色，并篩選潛在的干預(yù)藥物。
主要技術(shù)方法
研究采用了多種關(guān)鍵技術(shù)：
①構(gòu)建 STZ 誘導(dǎo)糖尿病小鼠和 db/db 小鼠兩種 DN 動(dòng)物模型，結(jié)合臨床 DN 患者血漿樣本，分析鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物；
②通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、染色質(zhì)免疫沉淀（CUT&RUN）和電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）驗(yàn)證 VDR 與 GPX4 啟動(dòng)子的結(jié)合；
③利用免疫沉淀 - 質(zhì)譜（IP-MS）篩選 VDR 相互作用蛋白，結(jié)合分子對(duì)接、表面等離子體共振（SPR）和高效親和珠靶向釣取技術(shù)確定小檗堿（BBR）與 PRPF19 的結(jié)合；
④通過 RNA 測(cè)序（RNA-seq）、透射電鏡（TEM）和免疫熒光等技術(shù)分析腎組織病理及分子表達(dá)變化。
研究結(jié)果
鐵死亡是 DN 晚期主要的細(xì)胞死亡形式
通過給高脂喂養(yǎng)的 STZ 誘導(dǎo)糖尿病小鼠腹腔注射不同細(xì)胞死亡抑制劑，發(fā)現(xiàn)早期 DN 中壞死性凋亡抑制劑 Nec-1 可改善腎功能，而晚期 DN 中鐵死亡抑制劑 Fer-1 顯著減輕腎小管腫脹、間質(zhì)纖維化及線粒體損傷。臨床 DN 患者血漿中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA、4-HNE）和鐵過載標(biāo)志物（Ferritin、TfR1）升高，抗氧化物質(zhì)（GSH、GPX4）降低，證實(shí)鐵死亡在 DN 晚期的關(guān)鍵作用。
VDR 是 GPX4 的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子
RNA 測(cè)序和 Western blot 顯示 DN 模型中 GPX4 表達(dá)下調(diào)，且與 DN 進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。通過 4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證實(shí) VDR 通過結(jié)合 GPX4 啟動(dòng)子區(qū) AGGGTCA 序列（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 1423-1430 bp）促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。VDR 敲除小鼠（VDR-cKO）在 STZ+HFD 誘導(dǎo)后，GPX4 表達(dá)顯著降低，脂質(zhì)過氧化加劇，腎功能惡化，而 VDR 激動(dòng)劑帕立骨化醇（PAR）可改善腎損傷，表明 VDR 通過調(diào)控 GPX4 抑制鐵死亡。
PRPF19 介導(dǎo) VDR 的泛素化降解
IP-MS 篩選出 VDR 互作蛋白 PRPF19（E3 泛素連接酶），免疫熒光和 Co-IP 證實(shí)兩者在細(xì)胞質(zhì)共定位，且 AGEs 刺激增強(qiáng)其相互作用。PRPF19 過表達(dá)降低 VDR 蛋白水平，敲除則升高 VDR，泛素化實(shí)驗(yàn)表明 PRPF19 促進(jìn) VDR 泛素化降解。機(jī)制上，PRPF19 通過泛素 - 蛋白酶體途徑調(diào)控 VDR 穩(wěn)定性，影響 GPX4 表達(dá)及鐵死亡進(jìn)程。
小檗堿（BBR）靶向 PRPF19 抑制 VDR 降解
分子對(duì)接顯示 BBR 與 PRPF19 結(jié)合能最低（-8.3 kcal/mol），SPR 證實(shí)兩者直接結(jié)合（KD=3.38×10-6 M）。BBR-immobilized beads pull-down 實(shí)驗(yàn)富集到 PRPF19，且 BBR 可競(jìng)爭(zhēng)性抑制 VDR 與 PRPF19 結(jié)合，減少 VDR 泛素化。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，BBR 通過抑制 PRPF19 介導(dǎo)的 VDR 降解，恢復(fù) GPX4 表達(dá)，減輕脂質(zhì)過氧化和線粒體損傷，改善 DN 小鼠腎功能。
研究結(jié)論與意義
本研究揭示了 DN 腎小管損傷中 “PRPF19/VDR/GPX4” 軸的關(guān)鍵作用：PRPF19 通過泛素化降解 VDR，下調(diào) GPX4 表達(dá)，促進(jìn)鐵死亡；而 BBR 作為 PRPF19 新型抑制劑，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 PRPF19，穩(wěn)定 VDR，抑制鐵死亡，減輕腎損傷。研究首次明確鐵死亡在 DN 晚期的主導(dǎo)地位，闡明 VDR 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 GPX4 的分子機(jī)制及 PRPF19 的降解作用，為 DN 治療提供了 PRPF19 這一潛在靶點(diǎn)，并驗(yàn)證了 BBR 的腎保護(hù)效應(yīng)，為中藥活性成分在 DN 中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，研究為理解 DN 中細(xì)胞死亡方式的動(dòng)態(tài)變化及轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新視角，有助于推動(dòng)靶向鐵死亡的精準(zhǔn)治療策略發(fā)展。
