深圳子科生物報(bào)道：多年來，研究人員一直在探索T細(xì)胞基因重組的可能性，以用于臨床應(yīng)用，如癌癥免疫治療、遺傳性疾病基因矯正和病原體抗藥性研究等。雖然CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的發(fā)展為T細(xì)胞改造提供了強(qiáng)有力的新型方法，但由于這種方法依賴于通過病毒來傳遞同源定向修復(fù)（HDR）模板，存在基因組隨機(jī)整合所可能產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，還有部分原因是由于雙鏈DNA(dsDNA) 在電轉(zhuǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，使得這項(xiàng)技術(shù)在臨床上的應(yīng)用受到了限制。

最近在《Nature》雜志上發(fā)表了一項(xiàng)突破性的研究，Alexander Marson教授和他的同事描述了一種高效的T細(xì)胞改造方法，通過共電轉(zhuǎn)的方式將Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物與雙鏈DNA(dsDNA)或單鏈DNA(ssDNA) HDR模板共同導(dǎo)入至細(xì)胞中，可以繞過病毒傳遞的方式，最大限度地降低細(xì)胞毒性。利用這一方法，作者迅速糾正了T細(xì)胞中自體免疫相關(guān)的遺傳突變，這些T細(xì)胞來自于患有罕見的單基因遺傳病的同胞；同時(shí)通過這一方法對(duì)來源于健康供體的T細(xì)胞進(jìn)行了重編程，經(jīng)過重編程的T細(xì)胞在體外和體內(nèi)模型中都成功地靶向了癌細(xì)胞。

作者在開發(fā)一種非病毒的T細(xì)胞重編程方法時(shí)，不僅設(shè)計(jì)了一種更適合臨床應(yīng)用的解決方案，而且還將T細(xì)胞改造所需要的時(shí)間從數(shù)年或數(shù)月縮短到了數(shù)周，大大降低了成本，加快了發(fā)現(xiàn)的步伐，擴(kuò)大了發(fā)現(xiàn)的可能性。作者在Cas9：HDR模板比率和電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化上花費(fèi)了大量時(shí)間，單就這一點(diǎn)而言，在未來的許多年里可能會(huì)使研究界受益匪淺。

早就聽聞CRISPR/Cas9技術(shù)在T細(xì)胞改造方面具有一定的潛力，當(dāng)小編在Takara科學(xué)家的帶領(lǐng)下解讀這篇文章的時(shí)候，小編的心情是這樣的：“終于等到你，還好我沒放棄”。如果您跟小編一樣激動(dòng)，趕緊點(diǎn)擊本文最下方“閱讀原文”，了解Takara科學(xué)家是如何解讀的吧。

在這篇展現(xiàn)革命性成果的文章中，有一個(gè)美麗的身影，那就是Takara Bio公司的Guide-it長單鏈制備系統(tǒng)，它幫助作者們成功高效地制備出了ssDNA基因敲入（knockin）修復(fù)模板。ssDNA作為CRISPR基因敲入供體模板，由于其非特異性整合概率低、細(xì)胞毒性低的特性可以輕松實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確CRISPR基因敲入，讓我們獲得更為可信的基因編輯結(jié)果。關(guān)于這一點(diǎn)，本篇文章作者也深有體會(huì)。

“Similar to what has been described with viral HDR templates, we found evidence to suggest that double-stranded templates could integrate independent of target homology, albeit at low rates. These rare events could be reduced almost completely by using single-stranded DNA (ssDNA) templates.”

—Roth et al. 2018

Guide-it長單鏈制備系統(tǒng)提供了一種簡便的方法來制備CRISPR/Cas9或者其它基因編輯技術(shù)的基因敲入實(shí)驗(yàn)修復(fù)模板，可以制備長達(dá)5 kb的單鏈DNA寡核苷酸（500 bp-5 kb）。它選擇地消化降解雙鏈DNA PCR產(chǎn)物的正義鏈（sense strand）或者反義鏈（antisense strand），將其轉(zhuǎn)化為單鏈DNA，經(jīng)濟(jì)、簡便、錯(cuò)誤率低，是基因敲入研究科學(xué)家們的智慧之選。