?Click EdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒

貨號(hào)：ZK-PL4014

描述：

EdU（5-Ethynyl-2'- deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）是一種含有一個(gè)乙炔基團(tuán)的胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，當(dāng)將其注射到動(dòng)物體內(nèi)或者對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行孵育，這些小分子能夠迅速擴(kuò)散到各個(gè)器官組織，并滲入到細(xì)胞中，可以在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸苷（T）摻入到新合成的 DNA 中。EdU分子中的乙炔基團(tuán)能與熒光標(biāo)記的疊氮化合物探針在銅離子催化下發(fā)生“點(diǎn)擊”反應(yīng)形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，因此可以使新合成的 DNA 被相應(yīng)的熒光探針?biāo)鶚?biāo)記。EdU 檢測(cè)法同放射性標(biāo)記核苷摻入法相比，沒有放射性污染等限制因素；同 BrdU 檢測(cè)法相比，EdU 檢測(cè)法不需要 DNA 的變性處理，也不用抗原抗體反應(yīng)，這大大減少了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和時(shí)間，也使其變得更省時(shí)、更靈敏、更穩(wěn)定和更準(zhǔn)確。本試劑盒可用于檢測(cè)體外培養(yǎng)的細(xì)胞或動(dòng)物組織中細(xì)胞增殖情況。本試劑盒中熒光探針為紅色熒光，最大激發(fā)波長為 557nm，最大發(fā)射波長為 570 nm，處于增殖的細(xì)胞被標(biāo)記后，細(xì)胞核會(huì)顯示出明紅色熒光，通過配套常規(guī)細(xì)胞核染料共同標(biāo)記細(xì)胞核（本試劑盒提供 Hoechst 33342 細(xì)胞核染料），可用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等儀器直接觀察細(xì)胞增殖情況；也可以使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞群熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度，來判斷細(xì)胞周期中 S 期的 DNA 復(fù)制活性。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸
冰袋（wet ice）運(yùn)輸；-20℃避光保存，EdU催化試劑(試劑 A)及反應(yīng)緩沖液可4℃保存；有效期12個(gè)月。

組成：100次
EdU 儲(chǔ)存液（10 mM）：100μL
試劑 A（催化試劑）：120μL
試劑 B（熒光染料 iF555）：50μL
試劑 C（催化添加劑）：2×100mg（powder）
反應(yīng)緩沖液：20mL
Hoechst33342染色液：30μL

操作步驟

1.體外細(xì)胞樣品以及試劑準(zhǔn)備工作：

1.1.將細(xì)胞按一定密度均勻種植于細(xì)胞培養(yǎng)板中（種植密度，由細(xì)胞大小、生長快慢等因素決定），待細(xì)胞貼壁或恢復(fù)正常狀態(tài)后，進(jìn)行相應(yīng)的藥物刺激等處理（如檢測(cè)懸浮細(xì)胞，請(qǐng)按懸浮細(xì)胞常規(guī)操作方式進(jìn)行，整體實(shí)驗(yàn)均需添加離心等步驟）
1.2. 試劑C（催化添加劑）低速離心，加入1mL超純水溶解，并分裝后于-20℃存放備用
2. 體外細(xì)胞 EdU 標(biāo)記、固定及通透：
2.1.配制 2×EdU孵育工作液：每1mL 完全細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2μL EdU 存儲(chǔ)液（10 mM），即為 20μM 的 2×EdU 孵育工作液，并放入培養(yǎng)箱中預(yù)熱（建議預(yù)實(shí)驗(yàn)以 EdU 工作濃度為 10 μM 進(jìn)行摸索）
2.2.以半換液的模式，將培養(yǎng)板中原細(xì)胞培養(yǎng)基吸除一半，并補(bǔ)加等體積預(yù)熱的 2×EdU 孵育工作液，
孵育一定的時(shí)間（孵育的時(shí)間一般取決于對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長周期，通常占細(xì)胞周期 10%左右的時(shí)間。對(duì)于大北京普利萊基因技術(shù)有限公司 電話 010-62053186, 62027915 Email：多貼壁且生長較快的細(xì)胞，建議孵育 2 h 左右。具體情況，需要隨細(xì)胞特性、處理后實(shí)際情況等進(jìn)行調(diào)整。如需孵育較長時(shí)間可適當(dāng)降低 EdU 工作濃度；較短時(shí)間則可適當(dāng)提高 EdU 濃度）
2.3.將EdU標(biāo)記孵育后的細(xì)胞樣品，用PBS緩沖液清洗1-2次后，加入固定液，覆蓋細(xì)胞即可，室溫固定15min（如需用流式檢測(cè)，貼壁細(xì)胞此步之前先消化重懸后再固定，后續(xù)按懸浮細(xì)胞的處理方式即可）；用 PBS 緩沖液洗滌 2-3 次，每次 3-5 min；
2.4.去除PBS緩沖液，加入通透液，覆蓋細(xì)胞或組織即可，室溫孵育 15 min；
2.5. 去除通透液后使用 PBS 緩沖液洗滌 1-2 次，每次 3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟 4。3. 動(dòng)物 EdU 注射造模以及組織切片處理：
3.1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，以腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、尾靜脈注射等方式對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次或多次 EdU注射造模，一般實(shí)驗(yàn) EdU 用量和動(dòng)物體重的比值為 5 mg/kg，具體注射量根據(jù)研究內(nèi)容和動(dòng)物情況而定。本試劑盒中提供部分 EdU 儲(chǔ)存液，主要用于體外細(xì)胞 EdU 標(biāo)記，如需對(duì)動(dòng)物進(jìn)行 EdU 造模，可單獨(dú)訂購 EdU試劑；
3.2. 小腸等上皮組織細(xì)胞增殖速度快，大腦等組織細(xì)胞增殖速度慢，生長較快的組織部位通常標(biāo)記時(shí)間小于 12 小時(shí)，而生長較慢的組織標(biāo)記時(shí)間可能需幾天；最佳標(biāo)記時(shí)間根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)而定，由于小腸上皮組織增殖較快，建議取該類組織作為標(biāo)記參考；
3.3. 將造模動(dòng)物按照規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)處死后，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片；
a. 對(duì)于冰凍切片：放置恢復(fù)到室溫，加入適量固定液，室溫固定 15 min。去除固定液，用適量 PBS 緩沖液洗滌 3 次，每次 3-5 min；去除 PBS 緩沖液，用適量通透液覆蓋組織室溫孵育 10-15 min；去除通透液，用 PBS 緩沖液洗滌 1-2 次，每次 3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟 4。
b. 對(duì)于石蠟切片：切片脫蠟復(fù)水，PBS 洗滌 5 min。去除 PBS 緩沖液，加入通透液，覆蓋細(xì)胞或組織即可，室溫孵育 15 min；去除通透液后使用 PBS 緩沖液洗滌 1-2 次，每次 3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟 4。
4. EdU 點(diǎn)擊反應(yīng)：
4.1. 在細(xì)胞或組織固定和穿孔期間，配制點(diǎn)擊反應(yīng)液（對(duì)于不同樣本配制體系參考以下表中方案）對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞：本參考步驟是對(duì)應(yīng) 10 個(gè) 96 孔板樣品的體積用量（每孔 100 μL），可根據(jù)使用需求，等比例增加或減少配制量，請(qǐng)按下表順序依次添加組分，邊加邊混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）；
反應(yīng)緩沖液 935 μL
試劑 A：催化試劑 10 μL
試劑 B：熒光染料 iF5555 μL
試劑 C：催化添加劑 50 μL
總體積
1000 μL
對(duì)于組織細(xì)胞切片：參考下體系進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)液體系的配制，可根據(jù)切樣本數(shù)，等比例增加或減小配制量，每個(gè)切片樣本約用 100-200 μL 點(diǎn)擊反應(yīng)液覆蓋。
反應(yīng)緩沖液 928 μL
試劑 A：催化試劑10 μL
試劑 B：熒光染料 iF555 12 μL
試劑 C：催化添加劑 50 μL
總體積 1000 μL
4.2.去除上一步（步驟2.5或3.3）PBS 緩沖液，加入點(diǎn)擊反應(yīng)液，輕搖保證反應(yīng)液全部覆蓋細(xì)胞或組織，室溫避光孵育 30 min；
4.3.去除點(diǎn)擊反應(yīng)液，PBS緩沖液洗滌 2-3 次，每次3-5min（如無其他特別要求，即可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度或用其他儀器檢測(cè)熒光效果）。
5. 細(xì)胞核染色：
5.1.去除上一步PBS緩沖液，將 Hoechst 33342染色液與 PBS 緩沖液以1比500-1000比例稀釋后，加入覆蓋細(xì)胞，孵育 5min；
5.2.去除 Hoechst 33342 染色液，PBS 緩沖液洗滌2-3次，每次3-5min。
6.成像以及檢測(cè)分析
直接將體外培養(yǎng)的細(xì)胞或者組織切片樣品置于熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等儀器檢測(cè)，分析處于增殖的細(xì)胞占比；或者收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度（建議使用未經(jīng) EdU 標(biāo)記的細(xì)胞樣品作為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的陰性對(duì)照，并選擇合適的電壓），根據(jù)熒光強(qiáng)度，來判斷細(xì)胞周期中 S 期的 DNA 復(fù)制活性。本試劑盒試劑 B：（熒光染料 iF555）對(duì)應(yīng)的光譜特性為 Ex/Em：557 nm/570 nm（紅色）；Hoechst 33342染色液對(duì)應(yīng)的光譜特性為 Ex/Em：346 nm/460 nm（藍(lán)色）。

注意事項(xiàng)
1. 對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞，具體 EdU 使用濃度、孵育時(shí)間隨樣品以及研究目的的不同，可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
2. 部分組織細(xì)胞增殖速度緩慢，為了排除造模效果不佳等因素，建議選增殖快的組織樣品作為參照樣本（如腸道組織）。
3. 如果背景顏色過深，可能是實(shí)驗(yàn)中洗滌不充分、組織樣品固定時(shí)間過長、固定液殘余導(dǎo)致。
4. 試劑C：（EdU 催化添加試劑）易氧化，盡量避免長時(shí)間暴露于空氣中，配制成水溶液后，建議分裝保存；經(jīng)測(cè)試，如 EdU 催化添加試劑顏色發(fā)生輕微變化，點(diǎn)擊反應(yīng)催化體系依舊能夠正常進(jìn)行，如呈現(xiàn)棕色，表明該組分已失效，請(qǐng)棄用。
5. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴一次性手套。